应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 单酶切 总是连不上
181/1返回列表
查看: 2194  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yu123400

木虫 (正式写手)

[交流] 单酶切 总是连不上

载体10k.目的片段5k，只能单酶切KpnI.用的promega的T4连接酶，一般直接4℃连接过夜，好多次了，就是连不上，感觉好多都是载体自连，求助大神指点一下！！

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2017-01-20 15:36:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

linglingys

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by yu123400 at 2017-01-20 22:24:54
你好，我一般切完立即纯化连接，总感觉这样可以减少自连，是这样吗
...

主要是看切得是否干净吧，自连有一点点不怕但太多就说明没切好吧

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
15楼2017-01-20 22:26:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

yu123400

木虫 (正式写手)
一般37℃酶切2.5小时

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2017-01-20 15:42:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kang7650

银虫 (正式写手)
★
yu123400(金币+1): 谢谢参与
不懂

发自小木虫Android客户端
回复此楼
3楼2017-01-20 15:48:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linglingys

新虫 (小有名气)
★ ★
yu123400(金币+1): 谢谢参与
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-21 06:45:03
切久点，切载体以及插入片段切6个小时左右。本人SfiI单酶切就是这么做出来的

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
12楼2017-01-20 16:15:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
单酶切，载体去磷酸化，回收，连接时多加载体，使载体与目的片段的比例加大。
赞一下 回复此楼
13楼2017-01-20 21:41:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yu123400

木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by linglingys at 2017-01-20 16:15:33
切久点，切载体以及插入片段切6个小时左右。本人SfiI单酶切就是这么做出来的

你好，我一般切完立即纯化连接，总感觉这样可以减少自连，是这样吗

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
14楼2017-01-20 22:24:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yu123400

木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by linglingys at 2017-01-20 22:26:59
主要是看切得是否干净吧，自连有一点点不怕但太多就说明没切好吧
...

好的，谢谢！

发自小木虫Android客户端
回复此楼
16楼2017-01-20 22:27:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seascen2016

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切后最好跑胶看一下载体是否切开
另外，连接时可以把载体和片段的摩尔比上调至1:10或更多
我们用NEB的T4, 一般25摄氏度连接2个小时。不知道你这个4度过夜是不是时间有点长。
赞一下 回复此楼
17楼2017-01-21 15:37:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hch123

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还是要去磷酸化的，不然自连回非常严重。不过上面有个帖子说多加载体，其实是多加片段，这样能增加片段的竞争力。
赞一下(1人) 回复此楼
18楼2017-01-23 11:40:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
hongyingwu4楼
2017-01-20 15:50   回复  
yu123400(金币+1): 谢谢参与
小网虫v5875楼
2017-01-20 15:51   回复  
yu123400(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
吸血人狼城6楼
2017-01-20 15:51   回复  
yu123400(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
aboluo1983317楼
2017-01-20 16:02   回复  
yu123400(金币+1): 谢谢参与
hydzp8楼
2017-01-20 16:06   回复  
yu123400(金币+1): 谢谢参与
ajingne19楼
2017-01-20 16:07   回复  
yu123400(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
nono200910楼
2017-01-20 16:09   回复  
yu123400(金币+1): 谢谢参与
laozhu557211楼
2017-01-20 16:12   回复  
yu123400(金币+1): 谢谢参与
相关版块跳转 我要订阅楼主 yu123400 的主题更新
181/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭