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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 单酶切 总是连不上
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yu123400

木虫 (正式写手)

[交流] 单酶切 总是连不上

载体10k.目的片段5k，只能单酶切KpnI.用的promega的T4连接酶，一般直接4℃连接过夜，好多次了，就是连不上，感觉好多都是载体自连，求助大神指点一下！！

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1楼 2017-01-20 15:36:27
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linglingys

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by yu123400 at 2017-01-20 22:24:54
你好，我一般切完立即纯化连接，总感觉这样可以减少自连，是这样吗
...

主要是看切得是否干净吧，自连有一点点不怕但太多就说明没切好吧

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15楼2017-01-20 22:26:59
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普通回帖

yu123400

木虫 (正式写手)
一般37℃酶切2.5小时

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2楼2017-01-20 15:42:39
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kang7650

银虫 (正式写手)
★
yu123400(金币+1): 谢谢参与
不懂

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3楼2017-01-20 15:48:17
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linglingys

新虫 (小有名气)
★ ★
yu123400(金币+1): 谢谢参与
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-21 06:45:03
切久点，切载体以及插入片段切6个小时左右。本人SfiI单酶切就是这么做出来的

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12楼2017-01-20 16:15:33
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
单酶切，载体去磷酸化，回收，连接时多加载体，使载体与目的片段的比例加大。
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13楼2017-01-20 21:41:39
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yu123400

木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by linglingys at 2017-01-20 16:15:33
切久点，切载体以及插入片段切6个小时左右。本人SfiI单酶切就是这么做出来的

你好，我一般切完立即纯化连接，总感觉这样可以减少自连，是这样吗

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14楼2017-01-20 22:24:54
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yu123400

木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by linglingys at 2017-01-20 22:26:59
主要是看切得是否干净吧，自连有一点点不怕但太多就说明没切好吧
...

好的，谢谢！

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16楼2017-01-20 22:27:36
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seascen2016

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切后最好跑胶看一下载体是否切开
另外，连接时可以把载体和片段的摩尔比上调至1:10或更多
我们用NEB的T4, 一般25摄氏度连接2个小时。不知道你这个4度过夜是不是时间有点长。
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17楼2017-01-21 15:37:56
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hch123

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还是要去磷酸化的，不然自连回非常严重。不过上面有个帖子说多加载体，其实是多加片段，这样能增加片段的竞争力。
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18楼2017-01-23 11:40:07
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hongyingwu4楼
2017-01-20 15:50   回复  
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小网虫v5875楼
2017-01-20 15:51   回复  
yu123400(金币+1): 谢谢参与
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吸血人狼城6楼
2017-01-20 15:51   回复  
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aboluo1983317楼
2017-01-20 16:02   回复  
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hydzp8楼
2017-01-20 16:06   回复  
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ajingne19楼
2017-01-20 16:07   回复  
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nono200910楼
2017-01-20 16:09   回复  
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laozhu557211楼
2017-01-20 16:12   回复  
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