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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 超声破碎后蛋白在沉淀
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waiwai0105

金虫 (小有名气)

[求助] 超声破碎后蛋白在沉淀 已有2人参与

大肠杆菌表达可溶性蛋白,超声破碎后看着没破碎完全,不是那种清澈状,但是镜检看着破碎完全,然而做完纯化后产率超级低,
沉淀还能用破菌液重新悬浮破碎吗?
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1楼 2017-01-18 18:54:08
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
恐怕不行了。也可以试试再超声一下。不过，你的蛋白是包涵体的可能性比较大。是包涵体的话就需要做复性了。

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读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
2楼2017-01-18 19:18:49
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掌控恶魔

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据我们的经验来说，你超声2次后看一下菌液悬浮液的状况，如果比较清澈透光，说明是上清蛋白的几率很大，直接离心吧，超声次数太多容易让上清蛋白降解。如果超声1次或2次后还是浑浊不透光就说明是很大可能是包涵体蛋白。你的情况极可能是表达在包涵体中了。再次超声也没有用。其实超声几次后细胞已经破碎了。是否上清和包涵体和超声次数没有关系
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3楼2017-01-19 13:43:38
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waiwai0105

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 掌控恶魔 at 2017-01-19 13:43:38
根据我们的经验来说，你超声2次后看一下菌液悬浮液的状况，如果比较清澈透光，说明是上清蛋白的几率很大，直接离心吧，超声次数太多容易让上清蛋白降解。如果超声1次或2次后还是浑浊不透光就说明是很大可能是包涵体 ...

以前做过好几次了,都没有这种情况,这次就成包涵体表达了??
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4楼2017-01-19 14:42:46
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掌控恶魔

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by waiwai0105 at 2017-01-19 14:42:46
以前做过好几次了,都没有这种情况,这次就成包涵体表达了??...

你超声不可能把包涵体蛋白变成上清蛋白。以前可能本身是表达在上清中，只不过需要破碎多次才能出来。或者上清和包涵体都能表达。这次都确定是破碎完全了，那就估计是包涵体蛋白了。主要还是看你蛋白的目的，如果是研究功能的话只能复性，如果是其他例如免疫之类的包涵体就包涵体吧。
或者尝试做一下表达的优化死马当活马吧
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5楼2017-01-19 15:18:46
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