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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于启动子克隆
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于启动子克隆 已有2人参与

最近小虾在克隆一个基因启动子，想利用cDNA已知序列的的5'端设计引物去扩基因组DNA的启动子，不知道可行性有多高？另外是想请教几个问题：1）不同物种的同一基因启动子相似度高吗？2）cDNA的每段（外显子）拼接是不是都必须与启动子序列（DNA）完全已知，测序结果怎么cDNA5'端外显子衔接部分与启动子（DNA）序列有个别碱基差异呀？急盼回复！！谢谢
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
1楼 2016-11-04 09:52:24
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Anna Chen

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可行，我是用试剂盒做的，有差异应该也正常吧

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2楼2016-11-04 21:23:32
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韩晓兔

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-17 21:29:46
不能用cDNA做吧，万一你的5'cDNA中间间隔了内含子的话就出不来了，我用的Takara Gemone walking，一次也就400多
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4楼2016-11-08 09:26:29
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ztt2015

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-17 21:30:06
引用回帖:
1楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2016-11-04 09:52:24
最近小虾在克隆一个基因启动子，想利用cDNA已知序列的的5'端设计引物去扩基因组DNA的启动子，不知道可行性有多高？另外是想请教几个问题：1）不同物种的同一基因启动子相似度高吗？2）cDNA的每段（外显子）拼接是不 ...

可以，我这样一次克隆五个基因的启动子，成了三个，有两个一次没成就没在再做。如果你基因是race克隆的就应该和启动子上的一样；如果是根据同源序列直接设计引物克隆的会有个别碱基不一样，应该以启动子上的为准。再安启动子上的序列设计引物pcr扩增突变回来就可以了。

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5楼2016-11-08 09:41:11
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Anna Chen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by weiyuanzheng at 2016-11-07 14:31:00
我用的是Takara的试剂盒，每次才步移600bp左右，据说Clontech试剂盒一次可以走3k！！...

我一次克隆出1800

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6楼2016-11-08 10:45:42
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普通回帖

weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Anna Chen at 2016-11-04 21:23:32
可行，我是用试剂盒做的，有差异应该也正常吧

我用的是Takara的试剂盒，每次才步移600bp左右，据说Clontech试剂盒一次可以走3k！！
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
3楼2016-11-07 14:31:00
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jinnini125

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Anna Chen at 2016-11-04 21:23:32
可行，我是用试剂盒做的，有差异应该也正常吧

你好，你用的哪家试剂盒？效果如何？好做吗

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7楼2016-12-17 13:38:53
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jinnini125

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 韩晓兔 at 2016-11-08 09:26:29
不能用cDNA做吧，万一你的5'cDNA中间间隔了内含子的话就出不来了，我用的Takara Gemone walking，一次也就400多

这个试剂盒怎么样？好做不？我现在只有4个基因同源克隆出来的开放阅读框序列，可以直接用来设计引物吗？

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8楼2016-12-17 13:41:41
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Anna Chen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jinnini125 at 2016-12-17 13:38:53
你好，你用的哪家试剂盒？效果如何？好做吗
...

我做的时候还挺顺利的

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9楼2016-12-17 15:12:05
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LMM小仙女

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ztt2015 at 2016-11-08 09:41:11
可以，我这样一次克隆五个基因的启动子，成了三个，有两个一次没成就没在再做。如果你基因是race克隆的就应该和启动子上的一样；如果是根据同源序列直接设计引物克隆的会有个别碱基不一样，应该以启动子上的为准。 ...

想问一下为什么用软件预测的基因启动子上同一个转录因子结合位点有不同的序列？
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10楼2017-12-18 22:58:44
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