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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » western blot 问题
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18253592055

金虫 (正式写手)

[交流] western blot 问题

最近在做一个基因，WB检测表达量，我们是用片子曝光，每次化学发光的时候有特异型带，没有杂带，但是整张膜的背景很高，最近做了几次都是这种情况，刚开始以为是封闭时间太短，由封闭一小时变成了两小时（5%牛奶封闭），但是结果还是一样背景很高，导致有些带看的不是很清楚，同一张膜孵其他抗体就不会出现这种情况，我觉得可能是抗体出现的问题（抗体是用PBST配的），大家有没有碰到过这样的问题，有没有什么解决办法？

western blot 问题
99DF.tmp.jpg
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1楼 2016-08-16 22:30:09
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fengshen2005

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
抗体浓度太高了，提高一下稀释倍数

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7楼2016-08-18 06:40:32
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vxrcpy084
祝福
2楼2016-08-17 00:23:57
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
3楼2016-08-17 12:35:52
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nicole8808

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
电泳和转膜可能没做好

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nicole
4楼2016-08-17 17:49:56
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nicole8808

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一般抗体都是特异性的，杂交时不大会出问题，顶多可能杂交时温度控制

发自小木虫IOS客户端
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nicole
5楼2016-08-17 17:52:26
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harry007

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你曝光时间太长了嘛……

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6楼2016-08-18 04:13:31
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syhzlsd

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
减少抗体孵育时间或降低抗体浓度，孵育后增加洗膜的时间和次数
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8楼2016-08-21 16:48:30
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YoonChul

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by ghqiu09 at 2016-08-17 12:35:52
抗体用PBST稀释？不应该啊，应该用5%牛奶或者BSA

抗体稀释液不是固定的，除了你说的，还可以用TBST，具体的得看什么样子的抗体。
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人类是唯一会脸红的动物，或是唯一该脸红的动物。
9楼2016-09-07 21:30:33
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YoonChul

铜虫 (初入文坛)
原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够
解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
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人类是唯一会脸红的动物，或是唯一该脸红的动物。
10楼2016-09-07 21:31:57
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