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18253592055

金虫 (正式写手)

[交流] western blot 问题

最近在做一个基因,WB检测表达量,我们是用片子曝光,每次化学发光的时候有特异型带,没有杂带,但是整张膜的背景很高,最近做了几次都是这种情况,刚开始以为是封闭时间太短,由封闭一小时变成了两小时(5%牛奶封闭),但是结果还是一样背景很高,导致有些带看的不是很清楚,同一张膜孵其他抗体就不会出现这种情况,我觉得可能是抗体出现的问题(抗体是用PBST配的),大家有没有碰到过这样的问题,有没有什么解决办法?

western blot 问题
99DF.tmp.jpg
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fengshen2005

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
抗体浓度太高了,提高一下稀释倍数

发自小木虫Android客户端
7楼2016-08-18 06:40:32
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普通回帖
祝福
2楼2016-08-17 00:23:57
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

3楼2016-08-17 12:35:52
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nicole8808

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
电泳和转膜可能没做好

发自小木虫IOS客户端
nicole
4楼2016-08-17 17:49:56
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nicole8808

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
一般抗体都是特异性的,杂交时不大会出问题,顶多可能杂交时温度控制

发自小木虫IOS客户端
nicole
5楼2016-08-17 17:52:26
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harry007

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你曝光时间太长了嘛……

发自小木虫IOS客户端
6楼2016-08-18 04:13:31
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syhzlsd

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
减少抗体孵育时间或降低抗体浓度,孵育后增加洗膜的时间和次数
8楼2016-08-21 16:48:30
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YoonChul

铜虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by ghqiu09 at 2016-08-17 12:35:52
抗体用PBST稀释?不应该啊,应该用5%牛奶或者BSA

抗体稀释液不是固定的,除了你说的,还可以用TBST,具体的得看什么样子的抗体。
人类是唯一会脸红的动物,或是唯一该脸红的动物。
9楼2016-09-07 21:30:33
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YoonChul

铜虫 (初入文坛)

原因:封闭不够好,一抗浓度高,洗膜时间和次数不够
解决办法:降低一抗浓度,增加洗膜时间和次数。
经验:高背景可能是WB中最常见出现的问题,目的条带单一清晰,但是其他地方又弥漫性较为均一的背景(比较连续的)。其实只要我们注意操作规范,不偷工减料就很容易避免,洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次,不要改成5min*3次,或者10min*2次。
人类是唯一会脸红的动物,或是唯一该脸红的动物。
10楼2016-09-07 21:31:57
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