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小李纸11银虫 (正式写手)
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构建质粒载体和目的片段一直连不上，总是载体自连。。。 已有6人参与
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| 如题，构建质粒载体和目的片段一直连不上，总是载体自连，结果一看选择的两个限制性内切酶的酶切位点几乎相同，会产生互补的粘性末端，是这个原因么？酶切是完全的。。。该怎么办才能把目的片段连上去呢？求助。。。 |
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4楼2016-07-27 10:56:15
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5楼2016-07-27 11:10:23
6楼2016-07-27 13:01:21
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直接说摩尔数不就行了，我们一般采用1：3-1：10之间，因为估算不准确，所以我们做一组高比例，在做一组低比例的，转化前混合。这样的好处是只要有一组比例合适，就有足够量的连接产物。 发自小木虫Android客户端 |
16楼2016-07-30 08:21:59
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:06:11
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载体和片段摩尔比1:3到1:5试一试，其实这是一个概率问题，只不过你的成功链接的概率低而已，如果不能提高链接效率，那就增加验证的菌落数量，挑单菌落的时候多挑一点（十个以上），如果嫌麻烦的话，把五个单菌落混到一起，这样十组就有50个，把这十组做pcr验证，如果有目的条带的话就划板,之后十分之一的概率能挑到阳性转化子。 发自小木虫Android客户端 |
21楼2016-07-30 22:00:33
2楼2016-07-27 10:01:50
3楼2016-07-27 10:16:39
7楼2016-07-27 15:10:51
8楼2016-07-28 06:40:09
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你做链接时vector和insert的比例用的多少，我们实验室验证过，比例对连接的效率影响非常大 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-07-28 17:45:06
10楼2016-07-28 17:54:43