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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建质粒载体和目的片段一直连不上，总是载体自连。。。
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岳大白

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:06:11
载体和片段摩尔比1:3到1:5试一试，其实这是一个概率问题，只不过你的成功链接的概率低而已，如果不能提高链接效率，那就增加验证的菌落数量，挑单菌落的时候多挑一点（十个以上），如果嫌麻烦的话，把五个单菌落混到一起，这样十组就有50个，把这十组做pcr验证，如果有目的条带的话就划板,之后十分之一的概率能挑到阳性转化子。

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21楼2016-07-30 22:00:33
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岳大白

新虫 (初入文坛)
前边说错了，应该是五分之一的概率调到阳性转化子

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22楼2016-07-30 22:03:14
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:06:19
加大片段的量试试，如果还是不行，最简单的办法就是重新找酶切位点，重新做了

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···
23楼2016-07-31 00:07:20
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tfytli

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

用磷酸酶把酶切位点5‘端的磷酸基团去掉就不会自连了，但是不要去目的片段的
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最令人信服的话莫过于一本正经的胡说八道，外加一点数据。
24楼2016-07-31 11:50:18
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coshark

金虫 (小有名气)
试试in fusion

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25楼2016-07-31 22:50:05
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tjabhm


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26楼2016-08-01 10:10:15
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ss2032

木虫 (正式写手)

咸鱼
引用回帖:
9楼: Originally posted by 弑者星魂 at 2016-07-28 17:45:06
你做链接时vector和insert的比例用的多少，我们实验室验证过，比例对连接的效率影响非常大

你好~请问一般怎么去判断加入的比例呢
谢谢
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努力翻身
27楼2016-08-31 17:41:54
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ss2032

木虫 (正式写手)

咸鱼
引用回帖:
16楼: Originally posted by 弑者星魂 at 2016-07-30 08:21:59
直接说摩尔数不就行了，我们一般采用1：3-1：10之间，因为估算不准确，所以我们做一组高比例，在做一组低比例的，转化前混合。这样的好处是只要有一组比例合适，就有足够量的连接产物。
...

请问高低两个浓度转化前混合，是怎样操作的呢
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努力翻身
28楼2016-08-31 17:43:17
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弑者星魂

金虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by ss2032 at 2016-08-31 17:43:17
请问高低两个浓度转化前混合，是怎样操作的呢...

他俩直接混合或者你把感受态加到两管中之后再混合。

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29楼2016-08-31 21:52:07
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弑者星魂

金虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by ss2032 at 2016-08-31 17:41:54
你好~请问一般怎么去判断加入的比例呢
谢谢...

我们粗略估计一下，就是根据链接之前的琼脂糖电泳亮度

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30楼2016-08-31 21:53:50
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