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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建质粒载体和目的片段一直连不上，总是载体自连。。。
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小李纸11

银虫 (正式写手)

[求助] 构建质粒载体和目的片段一直连不上，总是载体自连。。。 已有6人参与

如题，构建质粒载体和目的片段一直连不上，总是载体自连，结果一看选择的两个限制性内切酶的酶切位点几乎相同，会产生互补的粘性末端，是这个原因么？酶切是完全的。。。该怎么办才能把目的片段连上去呢？求助。。。
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1楼 2016-07-27 09:28:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小李纸11

银虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:06:42
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-27 10:16:39
用的哪两个酶？根据你的说法，如果粘性末端互补，那肯定更容易自连。建议换酶。

KpnI和XbaI。。。粘性末端互补的。。。请问去磷酸化效果好吗？不太想换酶，因为这个载体的多克隆位点上酶切位点不多，理想的酶不太好找。。。
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4楼2016-07-27 10:56:15
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小李纸11

银虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:04:34
引用回帖:
2楼: Originally posted by 草溪河 at 2016-07-27 10:01:50
载体去磷酸化吧

请问去磷酸化效果好吗？会不会连接后又出现许多连反了的情况呢？
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5楼2016-07-27 11:10:23
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:06:51
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小李纸11 at 2016-07-27 10:56:15
KpnI和XbaI。。。粘性末端互补的。。。请问去磷酸化效果好吗？不太想换酶，因为这个载体的多克隆位点上酶切位点不多，理想的酶不太好找。。。...

这两个酶可以一起使用，可以试试去磷酸化降低自连。
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6楼2016-07-27 13:01:21
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弑者星魂

金虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:07:00
引用回帖:
15楼: Originally posted by baishaoyun at 2016-07-30 01:18:50
请问二者比例多少比较合适呢？这个和体积和浓度都有关吧？
...

直接说摩尔数不就行了，我们一般采用1：3-1：10之间，因为估算不准确，所以我们做一组高比例，在做一组低比例的，转化前混合。这样的好处是只要有一组比例合适，就有足够量的连接产物。

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16楼2016-07-30 08:21:59
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岳大白

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:06:11
载体和片段摩尔比1:3到1:5试一试，其实这是一个概率问题，只不过你的成功链接的概率低而已，如果不能提高链接效率，那就增加验证的菌落数量，挑单菌落的时候多挑一点（十个以上），如果嫌麻烦的话，把五个单菌落混到一起，这样十组就有50个，把这十组做pcr验证，如果有目的条带的话就划板,之后十分之一的概率能挑到阳性转化子。

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21楼2016-07-30 22:00:33
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普通回帖

草溪河

铁虫 (著名写手)
载体去磷酸化吧

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2楼2016-07-27 10:01:50
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-27 22:18:08
xn8008: 应助指数+1 2016-07-30 16:07:06
用的哪两个酶？根据你的说法，如果粘性末端互补，那肯定更容易自连。建议换酶。
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3楼2016-07-27 10:16:39
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:07:13
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7楼2016-07-27 15:10:51
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得意地笑

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:07:19
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:07:30
可以用cip酶处理载体，这样就不会自连了。
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8楼2016-07-28 06:40:09
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弑者星魂

金虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:04:52
你做链接时vector和insert的比例用的多少，我们实验室验证过，比例对连接的效率影响非常大

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9楼2016-07-28 17:45:06
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斑马猴

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:04:58
可以用国产同源重组酶，效率很高，半小时搞定

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10楼2016-07-28 17:54:43
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