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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建质粒载体和目的片段一直连不上，总是载体自连。。。
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小李纸11

银虫 (正式写手)

[求助] 构建质粒载体和目的片段一直连不上，总是载体自连。。。 已有6人参与

如题，构建质粒载体和目的片段一直连不上，总是载体自连，结果一看选择的两个限制性内切酶的酶切位点几乎相同，会产生互补的粘性末端，是这个原因么？酶切是完全的。。。该怎么办才能把目的片段连上去呢？求助。。。
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1楼 2016-07-27 09:28:57
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:06:51
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小李纸11 at 2016-07-27 10:56:15
KpnI和XbaI。。。粘性末端互补的。。。请问去磷酸化效果好吗？不太想换酶，因为这个载体的多克隆位点上酶切位点不多，理想的酶不太好找。。。...

这两个酶可以一起使用，可以试试去磷酸化降低自连。
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6楼2016-07-27 13:01:21
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草溪河

铁虫 (著名写手)
载体去磷酸化吧

发自小木虫Android客户端
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2楼2016-07-27 10:01:50
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-27 22:18:08
xn8008: 应助指数+1 2016-07-30 16:07:06
用的哪两个酶？根据你的说法，如果粘性末端互补，那肯定更容易自连。建议换酶。
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3楼2016-07-27 10:16:39
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小李纸11

银虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:06:42
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-27 10:16:39
用的哪两个酶？根据你的说法，如果粘性末端互补，那肯定更容易自连。建议换酶。

KpnI和XbaI。。。粘性末端互补的。。。请问去磷酸化效果好吗？不太想换酶，因为这个载体的多克隆位点上酶切位点不多，理想的酶不太好找。。。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2016-07-27 10:56:15
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