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小李纸11

银虫 (正式写手)

[求助] 构建质粒载体和目的片段一直连不上,总是载体自连。。。 已有6人参与

如题,构建质粒载体和目的片段一直连不上,总是载体自连,结果一看选择的两个限制性内切酶的酶切位点几乎相同,会产生互补的粘性末端,是这个原因么?酶切是完全的。。。该怎么办才能把目的片段连上去呢?求助。。。
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-27 22:18:08
xn8008: 应助指数+1 2016-07-30 16:07:06
用的哪两个酶?根据你的说法,如果粘性末端互补,那肯定更容易自连。建议换酶。
3楼2016-07-27 10:16:39
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草溪河

铁虫 (著名写手)

2楼2016-07-27 10:01:50
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小李纸11

银虫 (正式写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:06:42
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-27 10:16:39
用的哪两个酶?根据你的说法,如果粘性末端互补,那肯定更容易自连。建议换酶。

KpnI和XbaI。。。粘性末端互补的。。。请问去磷酸化效果好吗?不太想换酶,因为这个载体的多克隆位点上酶切位点不多,理想的酶不太好找。。。
4楼2016-07-27 10:56:15
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小李纸11

银虫 (正式写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:04:34
引用回帖:
2楼: Originally posted by 草溪河 at 2016-07-27 10:01:50
载体去磷酸化吧

请问去磷酸化效果好吗?会不会连接后又出现许多连反了的情况呢?
5楼2016-07-27 11:10:23
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