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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小李纸11 at 2016-07-27 10:56:15
KpnI和XbaI。。。粘性末端互补的。。。请问去磷酸化效果好吗?不太想换酶,因为这个载体的多克隆位点上酶切位点不多,理想的酶不太好找。。。...

这两酶不互补

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11楼2016-07-29 21:35:36
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留兰香薄荷

铁虫 (初入文坛)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:07:57
还是重新设计一条引物吧。我也遇到过这样情况。增大DNA片段浓度1:4~7.试试30~50ul体系。
12楼2016-07-29 22:28:58
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飞翔的吉大人

新虫 (初入文坛)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:05:13
定向克隆会解决这个问题

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13楼2016-07-29 22:42:13
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1501993727

金虫 (小有名气)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:05:29
有一种去磷酸化的酶

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14楼2016-07-29 23:19:38
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baishaoyun

新虫 (小有名气)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:05:36
引用回帖:
9楼: Originally posted by 弑者星魂 at 2016-07-28 17:45:06
你做链接时vector和insert的比例用的多少,我们实验室验证过,比例对连接的效率影响非常大

请问二者比例多少比较合适呢?这个和体积和浓度都有关吧?

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15楼2016-07-30 01:18:50
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弑者星魂

金虫 (正式写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-30 16:07:00
引用回帖:
15楼: Originally posted by baishaoyun at 2016-07-30 01:18:50
请问二者比例多少比较合适呢?这个和体积和浓度都有关吧?
...

直接说摩尔数不就行了,我们一般采用1:3-1:10之间,因为估算不准确,所以我们做一组高比例,在做一组低比例的,转化前混合。这样的好处是只要有一组比例合适,就有足够量的连接产物。

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16楼2016-07-30 08:21:59
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:05:44
本帖内容被屏蔽

17楼2016-07-30 14:16:17
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yangtzelv

新虫 (小有名气)

这两个酶完全没问题,操作问题还是。
18楼2016-07-30 16:07:54
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siyuansing

银虫 (小有名气)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-31 08:05:55
连接不上跟连接时候的载体和目的片段的浓度浓度比例很有关系。产生相同的粘性末端那肯定是自连现象比较多,那么如果可以用蓝白斑筛选的话会提高成功率。另外建议换酶切位点,如果不方便换酶切位点可以考虑NEB的T4聚合酶,注意不是T4连接酶,具体的可以看相关文献和说明书,连接会很方便。

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19楼2016-07-30 21:46:10
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20楼2016-07-30 21:49:07
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