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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 多糖分离纯化求助，DEAE-52
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lpz598417258

铁虫 (初入文坛)

[求助] 多糖分离纯化求助，DEAE-52 已有2人参与

本人做多糖纯化，梯度洗脱，跑了四次，都不理想。求哪位分离纯化帮忙，求顺利毕业！！
现在把就具体的参数说明下：填料DEAE-52，柱子为2.6*40，0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 NaCl Tris-HCl溶液洗脱，多糖分子量是10万 Da左右。

讲实话，这些图我自己都看不下去了。实验的我做的真是没脾气，想请教哪位大神可以帮我分析下这些洗脱图。给点意见，到底是我参数没有设定好，还是柱子或者填料选择有问题？？

多糖分离纯化求助，DEAE-52
第一次，上样量100mg 流速：1ml/ml 每管1min 每个梯度跑80根管，但隔空测定，每个梯度40根管。


多糖分离纯化求助，DEAE-52-1
第二次，参数同第一次。第一次单是用缓冲液就直接全冲出来了，怀疑是柱子没填实，此次将柱子附加了填料，并压实。


多糖分离纯化求助，DEAE-52-2
第三次，参数同第一次。


多糖分离纯化求助，DEAE-52-3
第四次，总结前三次，怀疑是流速太大，低极性浓度时就全洗出了。这次将填料用酸碱和水处理，再生了下。参数调整为上样量为25mg, 0.5 ml/min 每个梯度收集20根管，没根管10min。依次测定
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1楼 2016-07-19 17:02:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

玉面女侠小菲

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lpz598417258: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-07-25 23:12:30
我觉得可能是填料没有处理好。第一，再生后的填料要进行脱气，如果脱气不好会影响你洗脱的结果；第二，脱气后的填料在装柱的时候要进行引流，而且不能出现断层，在装柱过程中，要在柱子底部留1-2cm缓冲液，装柱过程中恒流泵要开着；第三，装柱后要进行平衡，用缓冲液平衡柱子，直到柱子的高度和液位的高度不再变化才可以上样，不能压柱子，最好在柱子上层加一张定性滤纸，防止上样过程中，破坏柱子表层的平面。第四，平衡柱子的流速一般要高于洗脱时的流速。
之前做分离的一些心得，希望对你有用！
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奋斗不息
5楼2016-07-25 22:14:55
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普通回帖

lpz598417258

铁虫 (初入文坛)
我们实验室，就我自己做多糖，所以基本都是自己在折腾这些东西。孤立求援啊！！
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2楼2016-07-19 17:04:04
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lpz598417258: 金币+2, ★有帮助 2016-07-20 18:07:17
可以尝试羟丙基葡聚糖凝胶LH-20的填料，或者DEAE高流速琼脂糖凝胶，或者Q高流速琼脂糖凝胶。
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3楼2016-07-20 17:43:41
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lpz598417258

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hc-material at 2016-07-20 17:43:41
可以尝试羟丙基葡聚糖凝胶LH-20的填料，或者DEAE高流速琼脂糖凝胶，或者Q高流速琼脂糖凝胶。

我想再试一下，DEAE-52这个填料蛮贵的。我想多尝试下，如果真不行，再考虑换填料。
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4楼2016-07-20 18:08:41
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lpz598417258

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 玉面女侠小菲 at 2016-07-25 22:14:55
我觉得可能是填料没有处理好。第一，再生后的填料要进行脱气，如果脱气不好会影响你洗脱的结果；第二，脱气后的填料在装柱的时候要进行引流，而且不能出现断层，在装柱过程中，要在柱子底部留1-2cm缓冲液，装柱过程 ...

我处理时着重注意了这些方面，接了本这方面的书也请教了别人，没有发现柱子中有气泡或者柱子断层之类的情况。真是搞不明白了，准备换换填料试一试。
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6楼2016-07-26 10:19:12
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玉面女侠小菲

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lpz598417258 at 2016-07-26 10:19:12
我处理时着重注意了这些方面，接了本这方面的书也请教了别人，没有发现柱子中有气泡或者柱子断层之类的情况。真是搞不明白了，准备换换填料试一试。...

填料里的气泡是看不到的，你用旋蒸旋一下就看到气泡了，直到旋蒸的时候不再有气泡为止才可以装柱。这就是所谓的脱气。
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奋斗不息
7楼2016-07-26 10:55:50
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lpz598417258

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 玉面女侠小菲 at 2016-07-26 10:55:50
填料里的气泡是看不到的，你用旋蒸旋一下就看到气泡了，直到旋蒸的时候不再有气泡为止才可以装柱。这就是所谓的脱气。...

又跑了一次，结果还是不好。我重装柱子时，确实没有脱气。柱子装填中进行了引流，没有断层，也进行了平衡。那我试着脱气完装下柱子，再做一次吧。
还有些问题想请教：1，您说的在柱子上加一层定性滤纸，指的是在柱子高度不再变化，在其表面上加吗？？这样滤纸一直泡在液体里面，不就会烂掉掺在了填料中了吗？？
2，脱气操作能不能用超声波？？您是用旋蒸低压脱气，超声也可以除气泡，我觉得超声省时省事一些。
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8楼2016-07-27 09:07:18
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莎莎0526

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 玉面女侠小菲 at 2016-07-25 22:14:55
我觉得可能是填料没有处理好。第一，再生后的填料要进行脱气，如果脱气不好会影响你洗脱的结果；第二，脱气后的填料在装柱的时候要进行引流，而且不能出现断层，在装柱过程中，要在柱子底部留1-2cm缓冲液，装柱过程 ...

想问一下，再生后填柱子为什么水层总是不澄清。我洗了两遍都没用。这样对上样有影响么？填柱填了好几天了都不知道咋回事
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9楼2016-08-15 21:34:12
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zttkykbcg

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lpz598417258 at 2016-07-26 10:19:12
我处理时着重注意了这些方面，接了本这方面的书也请教了别人，没有发现柱子中有气泡或者柱子断层之类的情况。真是搞不明白了，准备换换填料试一试。...

我的毕设也是做多糖，我进样后，出不了峰。昨天把DEAE-52倒出来，重新装柱，还是没有出峰。第一次接触，一脸懵，求大神指点

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10楼2017-12-30 22:22:18
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