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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助，为什么我的DNA电泳一直失败
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洛一7轮

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，为什么我的DNA电泳一直失败 已有3人参与

是DNA降解了，还是退火温度过低，还是胶的问题。第二天跑，有条带了，但不是我想要的条带。
dna是水煮法提的，pcr是2*Taq,模板，上下引和dd水。变性95度5分钟，退火58度，延伸72度。电泳胶1.5%琼脂糖，dna大小200到500bp,电压90v。
不知道问题出在哪，求大神帮助我这个初入生物分子的人

求助，为什么我的DNA电泳一直失败


求助，为什么我的DNA电泳一直失败-1


@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-07-05 14:38:22
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memorize1991

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-07 07:34:03
xn8008: 应助指数+1 2016-07-07 08:46:28
引物二聚体比较严重，你是多大体系的？引物可能放多了，或者你设计的引物不太好。你可以先用CTAB法提下DNA，～～我做实验对DNA要求比较高，我用的试剂盒提的，目标片段长度在200～300bp之间。退火温度和你一样，PCR最后设定4摄氏度，hold。跑出来蛮好的～

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11楼2016-07-05 19:07:21
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18716248350

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的maker也没有跑好，可能胶有点问题，200-500bp用2%的琼脂糖，配15毫升的胶用微波炉低火打2分钟左右至液体澄清透明，水煮沸提模板没有问题，我也是这么做的，你煮沸的时候用封口胶封住盖口，25ul体系加1ul就够了，另外可以做一个梯度PCR看看退火温度是不是不准确。祝实验顺利
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17楼2016-07-06 19:31:23
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Forest666

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-07-07 07:35:10
一般PCR完之后放过夜应该是没事的，我一般是在程序的最后设一个20℃，时间无限长，第二天去收结果。看你跑胶的图，DNA没有降解的现象。估计是没扩增出来，不知道你的Marker是多大，我觉得图上的条带有可能是引物。确认你的模板没问题，然后改一下退火温度。
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ATGC
2楼2016-07-05 15:10:25
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洛一7轮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Forest666 at 2016-07-05 15:10:25
一般PCR完之后放过夜应该是没事的，我一般是在程序的最后设一个20℃，时间无限长，第二天去收结果。看你跑胶的图，DNA没有降解的现象。估计是没扩增出来，不知道你的Marker是多大，我觉得图上的条带有可能是引物。确 ...

marker1004

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3楼2016-07-05 15:50:33
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洛一7轮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Forest666 at 2016-07-05 15:10:25
一般PCR完之后放过夜应该是没事的，我一般是在程序的最后设一个20℃，时间无限长，第二天去收结果。看你跑胶的图，DNA没有降解的现象。估计是没扩增出来，不知道你的Marker是多大，我觉得图上的条带有可能是引物。确 ...

退火是要升还是降，模板应该没问题，有条带跑出来了

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4楼2016-07-05 15:52:31
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baiyu_560

金虫 (著名写手)
有引物二聚体，说明PCR体系没问题。偶尔能扩出条带，说明DNA模板没提好！水煮法新手难提好！建议用CTAB或SDS常规办法精提DNA试试！可通过电泳检测DNA质量。

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试一试又何妨？
5楼2016-07-05 16:09:24
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baiyu_560

金虫 (著名写手)
此外，跑200-500bp条带，胶浓度要2-3%。检测DNA质量用0.8-1%胶就行。

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试一试又何妨？
6楼2016-07-05 16:11:54
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洛一7轮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by baiyu_560 at 2016-07-05 16:09:24
有引物二聚体，说明PCR体系没问题。偶尔能扩出条带，说明DNA模板没提好！水煮法新手难提好！建议用CTAB或SDS常规办法精提DNA试试！可通过电泳检测DNA质量。

能问下如果一定要用水煮法，有没有什么要注意的，因为煮的过程感觉有水蒸气会跑进去

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7楼2016-07-05 16:14:18
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baiyu_560

金虫 (著名写手)
提取溶液新鲜配置，用新药品；保证叶片等组织完全浸入提取液，有必要的话剪碎；保证水煮温度及时间…关于水蒸气问题，只要不会煮爆，离心管中提取液预热后即可盖上管盖煮，管盖上盖一塑料板，橡皮筋绑好，可防煮爆…具体楼主视情况决定吧…

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试一试又何妨？
8楼2016-07-05 16:22:46
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
水煮法提取的DNA纯度不好，做PCR肯定有影响，另外看你的图，引物二聚体比较严重，另外，你制备的琼脂糖凝胶也有问题。
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9楼2016-07-05 17:12:25
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洛一7轮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-05 17:12:25
水煮法提取的DNA纯度不好，做PCR肯定有影响，另外看你的图，引物二聚体比较严重，另外，你制备的琼脂糖凝胶也有问题。

具体能改善吗

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10楼2016-07-05 18:48:51
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