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lynn111666

铜虫 (初入文坛)

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[求助] RT后的cDNA可以稀释吗？已有1人参与

最近做RT-PCR，但是用Takara的RR047A做RT后得到的cDNA（共20μL），如果按Takara的RR420A做PCR的话，cDNA完全不够(20μL的PCR体系，加2μLcDNA)。
那可以先把得到的cDNA先稀释下，少加点吗？
能把20μL的PCR体系改成10μL的吗？
PCR试剂盒中的ROX可以不加吗？（PCR仪器：stepone plus）
谢谢！

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1楼2016-05-16 20:57:56

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030Selma

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cdna浓度要试了才知道，如果基因表达丰度很高的话，低点浓度为何不可？

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2楼2016-05-17 00:35:15

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atlanticwi

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.............................
cDNA从来都是要稀释用的！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！
cDNA从来都是要稀释用的！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！
cDNA从来都是要稀释用的！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！
只要你的起始量RNA按实验说明书来做（20 uL体系 1~10ug RNA）

但这不是重点！
重点是，RT后的cDNA含有众多杂质（反转录酶 buffer dNTPs Oligo等）这些对下游的PCR都是不利的。
所以需要稀释使用，做基因克隆，半定量我们一般稀释10~20倍
定量虽然不稀释，但是加的极少，一个孔加0.02ul

理论上做一次20ul体系的cDNA够你做很多很多很多很多很多很多很多很多很多实验的。

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