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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于Ct值的问题
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青青花草香

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于Ct值的问题 已有2人参与

请问各位大神，检测引物的时候RT-PCR是单峰，但是却没有Ct值是什么原因？

关于Ct值的问题


关于Ct值的问题-1


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1楼 2016-05-05 12:00:21
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
....................嗯

Ct和Melt Curve没有关系，单看amp plot就知道要不是模板量太低，就是扩增失败，如果你引物设计的差，全是引物二聚体，P不出任何东西，也能跑出来很漂亮的单峰
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Let God do with it as He wills
2楼2016-05-05 13:09:28
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Liumengya

木虫 (正式写手)
跑了多少个循环？看你的溶解曲线应该是有产物的

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青青花草香
3楼2016-05-08 21:55:42
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mm3020

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

熔解曲线峰值80度都不到，肯定不是产物，应该是引物。无扩增产物出现

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4楼2016-05-08 22:50:08
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heady_z

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这个是ABI step one plus的机子跑的吧，看看是不是前面分析时候参数没设对，参照荧光那里你选了ROX，如果你体系里没加ROX，要钩none
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5楼2016-05-09 16:57:08
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青青花草香

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by Liumengya at 2016-05-08 21:55:42
跑了多少个循环？看你的溶解曲线应该是有产物的

40个循环

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6楼2016-05-10 00:00:28
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青青花草香

新虫 (初入文坛)
是不是模板有问题也会这样呢？

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7楼2016-05-10 00:01:37
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青青花草香

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by heady_z at 2016-05-09 16:57:08
这个是ABI step one plus的机子跑的吧，看看是不是前面分析时候参数没设对，参照荧光那里你选了ROX，如果你体系里没加ROX，要钩none

选了none

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8楼2016-05-10 00:02:51
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青青花草香

新虫 (初入文坛)
关于Ct值的问题-2

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9楼2016-05-10 00:03:32
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jackyoung

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-05 13:09:28
....................嗯

Ct和Melt Curve没有关系，单看amp plot就知道要不是模板量太低，就是扩增失败，如果你引物设计的差，全是引物二聚体，P不出任何东西，也能跑出来很漂亮的单峰

绝逼引物二聚体或非特异括增，tm还不到80，肯定是在逗我。先做普通PCR加跑胶确定好了条件再上。
这种情况下很难出15-30之间的Ct，即使出了也不是你要研究的东西。

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CestLaVie
10楼2016-05-10 00:05:20
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