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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带时有时无求解
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xiong1990

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR条带时有时无求解 已有4人参与

做了3个多月的RT-PCR,始终条带都不是很亮(我的目的基因文献中都说是高表达而且比较稳定)，偶尔p不出来条带，但是内参都能P出来，前的几次P不出来排除后发现是引物失效了，重新合成引物后又有条带了，过完年再做2次又没有P出条带，重新合成引物也还是弄不出来，好着急，哪位大神能帮我指点下问题出在哪？顺便问一下大家的引物都是用什么稀释的？

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1楼 2016-03-13 20:33:48
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-15 08:53:07
RT-PCR由于使用的是cDNA所以操作过程应在冰上进行。
引物和cDNA都要注意降解问题，长时间不用放置在-20。
cDNA冰上融化后要混匀短离心再用。
适当调整两个循环参数，增加一两个试试。
重新提取RNA反转录。
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2楼2016-03-14 08:45:05
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ken19860823

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-15 08:53:26
内容已删除
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做基因修饰的老菜鸡
3楼2016-03-14 09:11:15
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王爱沫1

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2016-03-14 11:24:07
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xiong1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-14 09:11:15
你的引物怎么合成三次？你用的次数有那么多么？一般用到的引物都是稀释成10um/L,储备液是稀释成100um/L.你的这个用量太恐怖。一般引物合成的引物会给你一个稳定的nmol数，比如8.2nmol，那么你就加82ul水，这样就是1 ...

我的引物用量没那么大，主要是前几次合成的引物不知道什么原因都p不出条带，就只好重新合成

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5楼2016-03-14 15:25:19
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xiong1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王爱沫1 at 2016-03-14 11:24:07
我做的时候引物是用TAE缓冲液稀释的。

好的，谢谢啦！

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6楼2016-03-14 15:25:34
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xiong1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 08:45:05
RT-PCR由于使用的是cDNA所以操作过程应在冰上进行。
引物和cDNA都要注意降解问题，长时间不用放置在-20。
cDNA冰上融化后要混匀短离心再用。
适当调整两个循环参数，增加一两个试试。
重新提取RNA反转录。

谢谢，我都是按照你说的那样做的，可是还是没有条带，初步怀疑是引物的问题，但是重新合成也没有P出来，之前P出条带来的CDNA用新合成的引物也P不出来

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7楼2016-03-14 15:27:52
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xiong1990 at 2016-03-14 15:25:19
我的引物用量没那么大，主要是前几次合成的引物不知道什么原因都p不出条带，就只好重新合成
...

引物储备液可以保存一年没问题的，-20度保存么？？应该是引物保存不当。
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做基因修饰的老菜鸡
8楼2016-03-14 15:41:52
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xiong1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-14 15:41:52
引物储备液可以保存一年没问题的，-20度保存么？？应该是引物保存不当。...

我用完立马放在-20度保存了

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9楼2016-03-14 16:08:28
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mysw2006zhuo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiong1990 at 2016-03-14 15:25:34
好的，谢谢啦！
...

我用的是纯水

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10楼2016-03-14 16:09:53
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