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xiong1990

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR条带时有时无求解 已有4人参与

做了3个多月的RT-PCR,始终条带都不是很亮(我的目的基因文献中都说是高表达而且比较稳定),偶尔p不出来条带,但是内参都能P出来,前的几次P不出来排除后发现是引物失效了,重新合成引物后又有条带了,过完年再做2次又没有P出条带,重新合成引物也还是弄不出来,好着急,哪位大神能帮我指点下问题出在哪?顺便问一下大家的引物都是用什么稀释的?

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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-15 08:53:07
RT-PCR由于使用的是cDNA所以操作过程应在冰上进行。
引物和cDNA都要注意降解问题,长时间不用放置在-20。
cDNA冰上融化后要混匀短离心再用。
适当调整两个循环参数,增加一两个试试。
重新提取RNA反转录。
2楼2016-03-14 08:45:05
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ken19860823

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-15 08:53:26
内容已删除
做基因修饰的老菜鸡
3楼2016-03-14 09:11:15
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王爱沫1

禁虫 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

4楼2016-03-14 11:24:07
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xiong1990

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-14 09:11:15
你的引物怎么合成三次?你用的次数有那么多么?一般用到的引物都是稀释成10um/L,储备液是稀释成100um/L.你的这个用量太恐怖。一般引物合成的引物会给你一个稳定的nmol数,比如8.2nmol,那么你就加82ul水,这样就是1 ...

我的引物用量没那么大,主要是前几次合成的引物不知道什么原因都p不出条带,就只好重新合成

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5楼2016-03-14 15:25:19
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xiong1990

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 王爱沫1 at 2016-03-14 11:24:07
我做的时候引物是用TAE缓冲液稀释的。

好的,谢谢啦!

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6楼2016-03-14 15:25:34
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xiong1990

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 08:45:05
RT-PCR由于使用的是cDNA所以操作过程应在冰上进行。
引物和cDNA都要注意降解问题,长时间不用放置在-20。
cDNA冰上融化后要混匀短离心再用。
适当调整两个循环参数,增加一两个试试。
重新提取RNA反转录。

谢谢,我都是按照你说的那样做的,可是还是没有条带,初步怀疑是引物的问题,但是重新合成也没有P出来,之前P出条带来的CDNA用新合成的引物也P不出来

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7楼2016-03-14 15:27:52
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ken19860823

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by xiong1990 at 2016-03-14 15:25:19
我的引物用量没那么大,主要是前几次合成的引物不知道什么原因都p不出条带,就只好重新合成
...

引物储备液可以保存一年没问题的,-20度保存么??应该是引物保存不当。
做基因修饰的老菜鸡
8楼2016-03-14 15:41:52
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xiong1990

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by ken19860823 at 2016-03-14 15:41:52
引物储备液可以保存一年没问题的,-20度保存么??应该是引物保存不当。...

我用完立马放在-20度保存了

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9楼2016-03-14 16:08:28
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mysw2006zhuo

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by xiong1990 at 2016-03-14 15:25:34
好的,谢谢啦!
...

我用的是纯水

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10楼2016-03-14 16:09:53
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