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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带时有时无求解
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xiong1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by mysw2006zhuo at 2016-03-14 16:09:53
我用的是纯水
...

我是用去离子水灭菌后溶解的，实验室师姐做PCR时也是这样做的没出现过我这种问题，到我这就一直出问题

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11楼2016-03-14 16:11:24
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mysw2006zhuo

新虫 (初入文坛)
看样是提取RNA问题

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12楼2016-03-14 16:30:29
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xiong1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by mysw2006zhuo at 2016-03-14 16:30:29
看样是提取RNA问题

谢谢！已经排除了问题了，主要出在引物上，现在的问题是在引物的稀释和保存上，大家都是怎么稀释的？

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13楼2016-03-14 21:44:24
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xiong1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-14 08:45:05
RT-PCR由于使用的是cDNA所以操作过程应在冰上进行。
引物和cDNA都要注意降解问题，长时间不用放置在-20。
cDNA冰上融化后要混匀短离心再用。
适当调整两个循环参数，增加一两个试试。
重新提取RNA反转录。

谢谢啦！问题已经排除了，主要是引物没用了，你们又出现这种情况吗？引物用什么稀释才能稳定？

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14楼2016-03-14 21:45:42
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mysw2006zhuo

新虫 (初入文坛)
没出现过，引物保存很简单，直接冻起来

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15楼2016-03-14 21:51:33
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卡维斯

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by xiong1990 at 2016-03-14 21:45:42
谢谢啦！问题已经排除了，主要是引物没用了，你们又出现这种情况吗？引物用什么稀释才能稳定？
...

灭菌ddH2o稀释，母液-20，工作液常用在4度，长时间不用-20或者再稀释
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16楼2016-03-15 08:23:35
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MarchZR

银虫 (小有名气)
分子实验说不准，不过PCR就那几个组分，一个一个分析也没什么难的啊，
引物，模板，酶，dNTP，水，buffer
反应条件，镁离子，DMSO等，电泳胶等等。。。。
不过RT-PCR比较特殊，需要的灵敏度更高特异性也要更强，普通的酶操作要保持低温，就算是在冰上也很难避免非特异性产物，还是使用热启动Taq酶，保险一点，化学修饰的热启动Taq酶低温下能够完全抑制非特异性产物，RT-PCR起峰快，扩增特异性强，我们都是用热启动Taq酶扩增
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17楼2016-03-15 16:24:12
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桂洁

新虫 (初入文坛)
是条带有拖尾现象吗？

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18楼2016-03-15 16:54:52
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星心的回忆

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
内参P出来，引物P不出来，怀疑是引物不好，建议换引物，之前也碰到过这种情况，重新合成没用，建议换引物吧，设计引物的时候注意下
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19楼2016-03-16 17:24:44
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xiong1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 桂洁 at 2016-03-15 16:54:52
是条带有拖尾现象吗？

没有拖带现象，什么都没有

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20楼2016-03-17 13:01:01
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