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G号糖

木虫 (正式写手)

[求助] 条带在点样孔里不出来是什么原因？ 已有5人参与

最近做了菌落pcr，但是点样孔很亮，产物没有，什么原因怎么解决啊？
求赐教

条带在点样孔里不出来是什么原因？
IMG_20160310_214012.jpg
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1楼 2016-03-11 10:53:37
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
G号糖: 金币+2, ★★★很有帮助 2016-03-11 11:15:46
模板量太多了。引物无法与模板有效结合（引物二聚体很亮）
菌液的话稀释50倍以上加一微，平板菌落的话用灭菌牙签沾一下就行。
另外可以少加点引物
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2楼2016-03-11 10:59:38
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nannanz2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
G号糖: 金币+2, ★★★很有帮助 2016-03-11 11:15:56
本人认为，模板量太多，点样孔的亮亮的东西可能为蛋白等物质
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3楼2016-03-11 11:04:51
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G号糖

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-11 10:59:38
模板量太多了。引物无法与模板有效结合（引物二聚体很亮）
菌液的话稀释50倍以上加一微，平板菌落的话用灭菌牙签沾一下就行。
另外可以少加点引物

还想请教下你们做的菌落pcr制备菌液加0.2%SDS没有？
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4楼2016-03-11 11:17:04
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G号糖

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nannanz2012 at 2016-03-11 11:04:51
本人认为，模板量太多，点样孔的亮亮的东西可能为蛋白等物质

那怎么避免这些蛋白质呢
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5楼2016-03-11 11:17:35
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by G号糖 at 2016-03-11 11:17:04
还想请教下你们做的菌落pcr制备菌液加0.2%SDS没有？...

没有，通常是用现摇的一毫升EP管里面的菌液，直接稀释50-100倍加样。不过为了简化过程是沾取菌落做的，这样后续测序后可以根据测序结果再摇菌提取质粒。
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6楼2016-03-11 11:25:12
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌落pcr可能就是刮的菌体太多了，导致体系里面的蛋白等杂质比较多。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
7楼2016-03-11 12:09:55
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w420250304

铁虫 (初入文坛)
提下质粒吧，虽然麻烦点，但菌落PCR非特异条带一般较多。除非你质粒特别多，或者特异，否则没有太好的条带。

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King Mars
8楼2016-03-11 12:56:23
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袁小伟

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

菌落PCR要注意菌体的量，如果直接刮取菌斑的话一定要稀释后做模板，我做链球菌的经验是一个单菌落稀释20微ddH2O PCR时用枪头沾一下，或是0.5微，PCR出来效果还是很不错的。摇取菌液的话也是同理，注意把握i菌体的量，当然菌落PCR只能参考，质粒的话是最好的
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9楼2016-03-15 09:13:13
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王爱沫1

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
10楼2016-03-15 10:16:41
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