应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » In-fusion 克隆，做了很久没有出结果，求助
181/2返回列表12下一页
查看: 3380  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

你的蛔虫

新虫 (初入文坛)

[交流] In-fusion 克隆，做了很久没有出结果，求助 已有10人参与

最近一直在做in-fusion 克隆连接，片段插入载体（14300bp），目的片段1023bp。
买的In-Fusion Cloning Kit货号是639649，只包含一支50个反应的5×premix，一支pUC19线性化载体和一个2kb的片段。我按照说明书的方法配好反应混合液之后（载体150-200ng，目的片段80ng，载体和目的片段各1 uL,5×premix 1uL,总体系51uL），50℃反应15min，然后转化DH5α感受态细胞。转化至感受态细胞的的反应液的量2uL、3uL、5uL均用过。但是第二天发现只有阳性的pUC19正常长起了阳性单菌落，我的克隆样品一个菌都不长。引物同源序列片段检查了很多次，没有问题。载体和目的片段都是凝胶回收的纯化的。现在不知道问题出在哪里了，请有经验的虫友们出出招，多谢了！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2016-02-19 13:16:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

轩辕漪

禁虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-26 08:49:37
本帖内容被屏蔽
9楼2016-02-21 14:09:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

phyter

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-26 08:49:43
可以试试摩尔比1:3
overlap  20bp
载体150ng  ok

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2016-02-21 09:17:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

erryzhen

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
2楼2016-02-19 13:53:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

你的蛔虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by erryzhen at 2016-02-19 13:53:02
你的载体与目的片段的重复序列是多少呢？

15bp
回复此楼
3楼2016-02-19 14:30:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

adamhe

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
使用如意连kit,保证做得出来。in-Fusion有时接头搞不好会连接不成功，不怎么稳定
赞一下 回复此楼
4楼2016-02-19 16:31:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

adamhe

新虫 (初入文坛)
5楼2016-02-19 16:32:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

你的蛔虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by adamhe at 2016-02-19 16:31:09
使用如意连kit,保证做得出来。in-Fusion有时接头搞不好会连接不成功，不怎么稳定

谢谢楼主的答复，如意连kit都没听过。takara 的这个in-fusion还可以吧。
赞一下 回复此楼
6楼2016-02-20 19:24:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用诺唯赞  我们使用  按照上面说明就可以了

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
生命不息奋斗不止
8楼2016-02-21 11:38:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换个试剂盒，诺唯赞的ClonExoress II one step ,成功率很高，我连过不同长度的片段，几乎都OK、
赞一下 回复此楼
10楼2016-02-21 14:34:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 你的蛔虫 的主题更新
181/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 279求调剂 +3 dua1 2026-03-01 4/200 2026-03-02 00:23 by 大脸蛋子
[考研] 284求调剂 +8 天下熯 2026-02-28 8/400 2026-03-02 00:15 by 暮雨星晴
[考研] 材料学硕318求调剂 +5 February_Feb 2026-03-01 5/250 2026-03-01 23:31 by L135790
[基金申请] 成果系统访问量大，请一小时后再尝试。---NSFC啥时候好哦，已经两天这样了 +4 NSFC2026我来了 2026-02-28 4/200 2026-03-01 22:37 by 铁门栓
[考研] 275求调剂 +3 明远求学 2026-03-01 3/150 2026-03-01 22:29 by 刘兵
[硕博家园] 博士自荐 +7 科研狗111 2026-02-26 11/550 2026-03-01 22:24 by 哲平L
[考研] 272求调剂 +6 田智友 2026-02-28 6/300 2026-03-01 21:40 by 公瑾逍遥
[考研] 0805总分292，求调剂 +7 幻想之殇 2026-03-01 7/350 2026-03-01 21:22 by 公瑾逍遥
[考研] 化工299分求调剂 一志愿985落榜 +5 嘻嘻(*^ω^*) 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:47 by 无际的草原
[考研] 0856化工专硕求调剂 +12 董boxing 2026-03-01 12/600 2026-03-01 19:45 by 材子momo
[考研] 298求调剂 +6 axyz3 2026-02-28 6/300 2026-03-01 19:00 by 18137688336
[考研] 0856材料求调剂 +11 hyf hyf hyf 2026-02-28 12/600 2026-03-01 18:57 by 18137688336
[考研] 285求调剂 +8 满头大汗的学生 2026-02-28 8/400 2026-03-01 16:47 by caszguilin
[考研] 311求调剂 +6 亭亭亭01 2026-03-01 6/300 2026-03-01 15:41 by 324616
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 材料284求调剂，一志愿郑州大学英一数二专硕 +10 想上岸的土拨鼠 2026-02-28 10/500 2026-03-01 14:12 by yc258
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[考研] 311求调剂 +9 南迦720 2026-02-28 10/500 2026-03-01 10:55 by sunny81
[考博] 博士自荐 +4 kkluvs 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:19 by 馥安馥安
[论文投稿] Optics letters投稿被拒求助 30+3 luckyry 2026-02-26 4/200 2026-03-01 09:06 by babero
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭