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你的蛔虫

新虫 (初入文坛)

[交流] In-fusion 克隆,做了很久没有出结果,求助 已有10人参与

最近一直在做in-fusion 克隆连接,片段插入载体(14300bp),目的片段1023bp。
买的In-Fusion Cloning Kit货号是639649,只包含一支50个反应的5×premix,一支pUC19线性化载体和一个2kb的片段。我按照说明书的方法配好反应混合液之后(载体150-200ng,目的片段80ng,载体和目的片段各1 uL,5×premix 1uL,总体系51uL),50℃反应15min,然后转化DH5α感受态细胞。转化至感受态细胞的的反应液的量2uL、3uL、5uL均用过。但是第二天发现只有阳性的pUC19正常长起了阳性单菌落,我的克隆样品一个菌都不长。引物同源序列片段检查了很多次,没有问题。载体和目的片段都是凝胶回收的纯化的。现在不知道问题出在哪里了,请有经验的虫友们出出招,多谢了!
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adamhe

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
使用如意连kit,保证做得出来。in-Fusion有时接头搞不好会连接不成功,不怎么稳定
4楼2016-02-19 16:31:09
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erryzhen

禁虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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2楼2016-02-19 13:53:02
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你的蛔虫

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by erryzhen at 2016-02-19 13:53:02
你的载体与目的片段的重复序列是多少呢?

15bp
3楼2016-02-19 14:30:54
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你的蛔虫

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by adamhe at 2016-02-19 16:31:09
使用如意连kit,保证做得出来。in-Fusion有时接头搞不好会连接不成功,不怎么稳定

谢谢楼主的答复,如意连kit都没听过。takara 的这个in-fusion还可以吧。
6楼2016-02-20 19:24:55
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