| 查看: 1612 | 回复: 2 | ||
[求助]
用易错PCR和In-Fusion技术构建突变文库为什么不成功？ 已有1人参与
|
|
首先我用高保真的酶（NEB公司的Phusion酶）扩增目的片段（设计引物时使得目的基因的5'-末端分别与线性化载体末端含有15bp同源区段），然后将纯化后的PCR产物（切胶回收）与纯化后的线性化载体（切胶回收）用Clontech公司的In-Fusion酶连接并转化天根公司的TOP10感受态细胞，平板上出现上百个菌落，阳性克隆率达到75%。 然后我用易错PCR产物（同源区段也是15bp）与上述同样的线性化载体用In-Fusion酶连接并转化TOP10感受态细胞，易错PCR片段和载体的处理方法都是切胶回收，并且回收后的浓度都一样，即线性化载体50ng/ul、PCR片段100ng/ul，都是用NEB公司的1kb DNA Ladder定量的，结果平板上只长1-2个克隆，不知道这是怎么回事？ 易错PCR条件是：0.2mM dATP和dCTP,1mM dGTP和dTTP,7mM MgCl2,0.5mM MnCl2,并且是用保真性低的普通Taq酶进行扩增，不知道会不会是因为扩增后3‘末端的A尾巴影响了同源重组反应？但是Clontech公司的In-Fusion酶的说明书上说，PCR产物3’末端有无A并不影响啊。我现在也是找不出原因，为什么用高保真的PCR酶可以做出来，而低保真性的PCR酶做就做不出来呢？ |
回复此楼» 猜你喜欢
化工申博
已经有3人回复
-
申博自荐
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有96人回复
-
广西民族大学化学化工学院化学工程与技术学硕，材料化工专硕调剂名额充足！
已经有0人回复
-
透明质酸酶的作用机制：如何实现药物递送
已经有0人回复
-
爱思维尔旗下LWT投稿
已经有9人回复
-
替拉扎明为缺氧选择性细胞毒药物研究提供新思路
已经有0人回复
-
拉坦前列腺素(Latanoprost)：前列腺素F2α衍生物如何成为青光眼一线用药
已经有0人回复
-
卟啉家族中的明星分子：MESO-四(3,5-二溴-4-羟基苯基)卟啉的性质与制备
已经有1人回复
-
宠物寄生虫防治：氟雷拉纳阻断GABA受体，持效12周驱杀跳蚤蜱虫
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 进行点突变的pcr，不能扩增出产物
已经有3人回复
- 平末端连接，连上了，很多转化子中没有一个正确的，怎么办？
已经有13人回复
2楼2013-10-28 11:54:55
15222569263
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 262.5
- 散金: 5
- 帖子: 78
- 在线: 16.6小时
- 虫号: 4320216
- 注册: 2015-12-29
- 专业: 化学生物学与生物有机化学
3楼2016-03-17 21:31:25