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用易错PCR和In-Fusion技术构建突变文库为什么不成功？ 已有1人参与
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首先我用高保真的酶（NEB公司的Phusion酶）扩增目的片段（设计引物时使得目的基因的5'-末端分别与线性化载体末端含有15bp同源区段），然后将纯化后的PCR产物（切胶回收）与纯化后的线性化载体（切胶回收）用Clontech公司的In-Fusion酶连接并转化天根公司的TOP10感受态细胞，平板上出现上百个菌落，阳性克隆率达到75%。 然后我用易错PCR产物（同源区段也是15bp）与上述同样的线性化载体用In-Fusion酶连接并转化TOP10感受态细胞，易错PCR片段和载体的处理方法都是切胶回收，并且回收后的浓度都一样，即线性化载体50ng/ul、PCR片段100ng/ul，都是用NEB公司的1kb DNA Ladder定量的，结果平板上只长1-2个克隆，不知道这是怎么回事？ 易错PCR条件是：0.2mM dATP和dCTP,1mM dGTP和dTTP,7mM MgCl2,0.5mM MnCl2,并且是用保真性低的普通Taq酶进行扩增，不知道会不会是因为扩增后3‘末端的A尾巴影响了同源重组反应？但是Clontech公司的In-Fusion酶的说明书上说，PCR产物3’末端有无A并不影响啊。我现在也是找不出原因，为什么用高保真的PCR酶可以做出来，而低保真性的PCR酶做就做不出来呢？ |
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2楼2013-10-28 11:54:55
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