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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 用易错PCR和In-Fusion技术构建突变文库为什么不成功？
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lx0103

新虫 (小有名气)

[求助] 用易错PCR和In-Fusion技术构建突变文库为什么不成功？ 已有1人参与

首先我用高保真的酶（NEB公司的Phusion酶）扩增目的片段（设计引物时使得目的基因的5'-末端分别与线性化载体末端含有15bp同源区段），然后将纯化后的PCR产物（切胶回收）与纯化后的线性化载体（切胶回收）用Clontech公司的In-Fusion酶连接并转化天根公司的TOP10感受态细胞，平板上出现上百个菌落，阳性克隆率达到75%。
       然后我用易错PCR产物（同源区段也是15bp）与上述同样的线性化载体用In-Fusion酶连接并转化TOP10感受态细胞，易错PCR片段和载体的处理方法都是切胶回收，并且回收后的浓度都一样，即线性化载体50ng/ul、PCR片段100ng/ul，都是用NEB公司的1kb DNA Ladder定量的，结果平板上只长1-2个克隆，不知道这是怎么回事？
       易错PCR条件是：0.2mM dATP和dCTP,1mM dGTP和dTTP,7mM MgCl2,0.5mM MnCl2,并且是用保真性低的普通Taq酶进行扩增，不知道会不会是因为扩增后3‘末端的A尾巴影响了同源重组反应？但是Clontech公司的In-Fusion酶的说明书上说，PCR产物3’末端有无A并不影响啊。我现在也是找不出原因，为什么用高保真的PCR酶可以做出来，而低保真性的PCR酶做就做不出来呢？
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1楼 2013-09-29 16:13:25
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15222569263

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主，后来转化有阳性吗？我现在做易错PCR，遇到同样的问题，麻烦帮一下。谢谢！！！！！！！！
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3楼2016-03-17 21:31:25
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文库构建

铁虫 (小有名气)
突变体文库是通过Tn5转座或T-DNA插入到野生型病原菌基因组内，从而使病原菌的某个（些）基因失活而获得突变株，由于T-DNA的插入是随机的，每个基因都有失活的可能，这样足够多的突变体将构成该病原菌的突变体文库。突变体文库是研究病原菌基因功能的基本工具，在筛选高效菌株突变体、研究基因间的互作等方面具有重要的应用价值。


来源：百博明创（北京）
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2楼2013-10-28 11:54:55
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