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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于宝生物xho1酶的连接问题
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wj2423311236

银虫 (小有名气)

[求助] 关于宝生物xho1酶的连接问题 已有2人参与

最近在做双酶切后的连接，连续两次了做不出来，使用的酶是bamh1和xho1，其中xho1的说明书上说要用平末端的连接条件，可是bamh1却又要求黏末端的连接条件。现在很纠结到底用那个条件。还有平末端的连接条件是什么？新手表示很困扰啊。用的酶是宝生物的，载体是pet28a。
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1楼 2016-01-13 17:29:04
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gnice

金虫 (正式写手)
做过很多，常规条件就行。很好连

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2楼2016-01-13 18:03:24
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wj2423311236

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gnice at 2016-01-13 18:03:24
做过很多，常规条件就行。很好连

可是我两次都没做出来啊

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3楼2016-01-13 18:19:06
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wx1308897716

木虫 (小有名气)

神虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是要看下酶切可有问题，一般连接很少出问题
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4楼2016-01-13 18:51:48
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wj2423311236

银虫 (小有名气)
酶切对照上什么也没长

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5楼2016-01-13 19:18:53
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
您可以先将PCR产物连T载体（taq）或者平末端载体（pfu），抽提质粒后，再用这两个酶进行双酶切，
之后电泳回收目的片段，这样能够保证回收到的片段一定是有粘性末端的。连接成功率也会高很多。

若您直接将PCR产物进行酶切，很难保证片段百分百被酶切。并且限制性内切酶在DNA末端的酶切效率本身就很低，这种情况必须要添加保护碱基的。

若这两种酶实在不适合双酶切，也可以采用分步酶切法，即先单酶切，之后进行产物纯化，然后再进行另外一个酶切，之后再纯化，这样的好处是每一次酶切都是相应内切酶的最佳反应环境，但有致命缺点：经过多次纯化后的DNA片段浓度会很低。
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6楼2016-01-14 12:48:26
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wj2423311236

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-14 12:48:26
您可以先将PCR产物连T载体（taq）或者平末端载体（pfu），抽提质粒后，再用这两个酶进行双酶切，
之后电泳回收目的片段，这样能够保证回收到的片段一定是有粘性末端的。连接成功率也会高很多。

若您直接将PCR产 ...

非常感谢，我试试

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7楼2016-01-14 17:37:45
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LQF134

新虫 (初入文坛)
能连的，PCR后先提质粒对照再做双酶切
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8楼2016-01-27 12:03:45
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JH5HJ

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2020-12-29 11:15:46
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犹怜草木青

木虫 (职业作家)

热心群众铁柱儿
这种克隆方式已经属于旧技术了，你可以试试同源重组的方式连接。对酶切位点没有要求，对片段也没有要求。能一次重组上去多个片段。
只需要设计引物的时候价格同源臂就行了。
现在这是最方便的技术了。有兴趣的话自己就去找找相关技术视频看看。
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铁柱儿是个温柔的姐姐
10楼2020-12-31 18:18:58
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