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wj2423311236银虫 (小有名气)
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关于宝生物xho1酶的连接问题 已有2人参与
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| 最近在做双酶切后的连接，连续两次了做不出来，使用的酶是bamh1和xho1，其中xho1的说明书上说要用平末端的连接条件，可是bamh1却又要求黏末端的连接条件。现在很纠结到底用那个条件。还有平末端的连接条件是什么？新手表示很困扰啊。用的酶是宝生物的，载体是pet28a。 |
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2楼2016-01-13 18:03:24
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3楼2016-01-13 18:19:06
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4楼2016-01-13 18:51:48
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5楼2016-01-13 19:18:53
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【答案】应助回帖
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您可以先将PCR产物连T载体（taq）或者平末端载体（pfu），抽提质粒后，再用这两个酶进行双酶切， 之后电泳回收目的片段，这样能够保证回收到的片段一定是有粘性末端的。连接成功率也会高很多。 若您直接将PCR产物进行酶切，很难保证片段百分百被酶切。并且限制性内切酶在DNA末端的酶切效率本身就很低，这种情况必须要添加保护碱基的。 若这两种酶实在不适合双酶切，也可以采用分步酶切法，即先单酶切，之后进行产物纯化，然后再进行另外一个酶切，之后再纯化，这样的好处是每一次酶切都是相应内切酶的最佳反应环境，但有致命缺点：经过多次纯化后的DNA片段浓度会很低。 |
6楼2016-01-14 12:48:26
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