应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪
101/1返回列表
查看: 1534  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Ivy尘

新虫 (正式写手)

[求助] 挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪 已有1人参与

用植物材料提取的RNA、逆转录后作为模板PCR，之后连T载体挑菌，目标条带是1000bp,菌液PCR后只有一个接上目标条带，其他有数个连进了600bp的，想知道是什么，就一起送生工测序了。

测序结果：1000多的是目标片段，600多的中间缺400bp，其他部位和目标条带一毛一样。DNAMAN Alignment得到的。
挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪
挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪-1

我的想法：不可能是内含子吧，我是RNA逆转录的，引物也是按照转录组拼接得到的序列设计的。

可能1.600多的是植物自身的，是另一个基因？
可能2.产物断裂后，自连缺失了400bp,再接入T载体？

各位怎么想？求教！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2016-01-11 16:59:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

反应链

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-14 23:01:14
What is the size of your amplification if the template uses the genomic DNA?

According the results your described above, I doubt that the approximate 1000 bp fragment came from genomic DNA contaminant. Therefore, the 600 bp fragment would be the target DNA.
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2016-01-11 19:39:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-11 19:39:35
What is the size of your amplification if the template uses the genomic DNA?

According the results your described above, I doubt that the approximate 1000 bp fragment came from genomic DNA contam ...

我提取的RNA未进行去除基因组DNA操作，直接逆转录的，但是我是依照转录组拼接序列设计引物的，目标条带1000bp，应该不存在你说的问题。。
赞一下 回复此楼
3楼2016-01-11 20:59:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

反应链

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Ivy尘 at 2016-01-11 20:59:54
我提取的RNA未进行去除基因组DNA操作，直接逆转录的，但是我是依照转录组拼接序列设计引物的，目标条带1000bp，应该不存在你说的问题。。...

Can you confirm that your primers designed were cross-intron? Therefore, you should use the genomic DNA as the template for a positive test.
赞一下 回复此楼
4楼2016-01-11 21:08:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-11 21:08:55
Can you confirm that your primers designed were cross-intron? Therefore, you should use the genomic DNA as the template for a positive test....

Many thanks for you kind advice. I'll try to isolate genomic DNA as template.
赞一下 回复此楼
5楼2016-01-11 22:49:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

吕稀稀子

新虫 (初入文坛)
我之前也遇到过类似的情况，很郁闷。最后换了一对引物 结果才正常，希望以后能顺利

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2016-01-14 20:58:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

llsllslls92

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我觉得有两种可能
一是 设计引物时没有跨内含子设计，只要提RNA质量不好混有基因DNA就会把内含子给扩增出来
二是 基因的变位剪接导致的 有可能少的少的部分就是该基因的其中一个外显子序列 （最近做实验发现了这样的突变体了的 ）
个人观点而已～

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2016-01-15 02:05:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by llsllslls92 at 2016-01-15 02:05:58
我觉得有两种可能
一是 设计引物时没有跨内含子设计，只要提RNA质量不好混有基因DNA就会把内含子给扩增出来
二是 基因的变位剪接导致的 有可能少的少的部分就是该基因的其中一个外显子序列 （最近做实验发现了这样 ...

谢谢～

发自小木虫Android客户端
回复此楼
8楼2016-05-13 22:27:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sayen

银虫 (小有名气)
确定引物是否特异

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
9楼2016-05-13 23:25:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sayen at 2016-05-13 23:25:55
确定引物是否特异

谢谢～后来没再管短片段，因为长片段序列和预计的基本一致。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
10楼2016-05-16 10:47:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Ivy尘 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +3 启萌科技 2026-08-12 11/550 2026-08-13 22:57 by 启萌科技
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +9 Tide man 2026-08-10 10/500 2026-08-13 20:33 by 温淼淼淼
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +4 majunge000 2026-08-11 6/300 2026-08-13 16:50 by 四季常青藤
[基金申请] filecode +14 documentary 2026-08-10 16/800 2026-08-13 16:39 by 润生71
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭