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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

[求助] 挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪 已有1人参与

用植物材料提取的RNA、逆转录后作为模板PCR，之后连T载体挑菌，目标条带是1000bp,菌液PCR后只有一个接上目标条带，其他有数个连进了600bp的，想知道是什么，就一起送生工测序了。

测序结果：1000多的是目标片段，600多的中间缺400bp，其他部位和目标条带一毛一样。DNAMAN Alignment得到的。
挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪
挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪-1

我的想法：不可能是内含子吧，我是RNA逆转录的，引物也是按照转录组拼接得到的序列设计的。

可能1.600多的是植物自身的，是另一个基因？
可能2.产物断裂后，自连缺失了400bp,再接入T载体？

各位怎么想？求教！！！
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1楼 2016-01-11 16:59:47
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反应链

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-14 23:01:14
What is the size of your amplification if the template uses the genomic DNA?

According the results your described above, I doubt that the approximate 1000 bp fragment came from genomic DNA contaminant. Therefore, the 600 bp fragment would be the target DNA.
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2楼2016-01-11 19:39:35
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-11 19:39:35
What is the size of your amplification if the template uses the genomic DNA?

According the results your described above, I doubt that the approximate 1000 bp fragment came from genomic DNA contam ...

我提取的RNA未进行去除基因组DNA操作，直接逆转录的，但是我是依照转录组拼接序列设计引物的，目标条带1000bp，应该不存在你说的问题。。
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3楼2016-01-11 20:59:54
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反应链

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Ivy尘 at 2016-01-11 20:59:54
我提取的RNA未进行去除基因组DNA操作，直接逆转录的，但是我是依照转录组拼接序列设计引物的，目标条带1000bp，应该不存在你说的问题。。...

Can you confirm that your primers designed were cross-intron? Therefore, you should use the genomic DNA as the template for a positive test.
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4楼2016-01-11 21:08:55
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-11 21:08:55
Can you confirm that your primers designed were cross-intron? Therefore, you should use the genomic DNA as the template for a positive test....

Many thanks for you kind advice. I'll try to isolate genomic DNA as template.
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5楼2016-01-11 22:49:32
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吕稀稀子

新虫 (初入文坛)
我之前也遇到过类似的情况，很郁闷。最后换了一对引物 结果才正常，希望以后能顺利

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6楼2016-01-14 20:58:58
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llsllslls92

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我觉得有两种可能
一是 设计引物时没有跨内含子设计，只要提RNA质量不好混有基因DNA就会把内含子给扩增出来
二是 基因的变位剪接导致的 有可能少的少的部分就是该基因的其中一个外显子序列 （最近做实验发现了这样的突变体了的 ）
个人观点而已～

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7楼2016-01-15 02:05:58
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by llsllslls92 at 2016-01-15 02:05:58
我觉得有两种可能
一是 设计引物时没有跨内含子设计，只要提RNA质量不好混有基因DNA就会把内含子给扩增出来
二是 基因的变位剪接导致的 有可能少的少的部分就是该基因的其中一个外显子序列 （最近做实验发现了这样 ...

谢谢～

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8楼2016-05-13 22:27:23
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sayen

银虫 (小有名气)
确定引物是否特异

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9楼2016-05-13 23:25:55
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sayen at 2016-05-13 23:25:55
确定引物是否特异

谢谢～后来没再管短片段，因为长片段序列和预计的基本一致。

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10楼2016-05-16 10:47:10
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