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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

[求助] 挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪 已有1人参与

用植物材料提取的RNA、逆转录后作为模板PCR，之后连T载体挑菌，目标条带是1000bp,菌液PCR后只有一个接上目标条带，其他有数个连进了600bp的，想知道是什么，就一起送生工测序了。

测序结果：1000多的是目标片段，600多的中间缺400bp，其他部位和目标条带一毛一样。DNAMAN Alignment得到的。
挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪
挑菌测序，整成这样婶儿的结果，也是跪-1

我的想法：不可能是内含子吧，我是RNA逆转录的，引物也是按照转录组拼接得到的序列设计的。

可能1.600多的是植物自身的，是另一个基因？
可能2.产物断裂后，自连缺失了400bp,再接入T载体？

各位怎么想？求教！！！
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1楼 2016-01-11 16:59:47
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-11 21:08:55
Can you confirm that your primers designed were cross-intron? Therefore, you should use the genomic DNA as the template for a positive test....

Many thanks for you kind advice. I'll try to isolate genomic DNA as template.
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5楼2016-01-11 22:49:32
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反应链

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-14 23:01:14
What is the size of your amplification if the template uses the genomic DNA?

According the results your described above, I doubt that the approximate 1000 bp fragment came from genomic DNA contaminant. Therefore, the 600 bp fragment would be the target DNA.
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2楼2016-01-11 19:39:35
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-11 19:39:35
What is the size of your amplification if the template uses the genomic DNA?

According the results your described above, I doubt that the approximate 1000 bp fragment came from genomic DNA contam ...

我提取的RNA未进行去除基因组DNA操作，直接逆转录的，但是我是依照转录组拼接序列设计引物的，目标条带1000bp，应该不存在你说的问题。。
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3楼2016-01-11 20:59:54
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反应链

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Ivy尘 at 2016-01-11 20:59:54
我提取的RNA未进行去除基因组DNA操作，直接逆转录的，但是我是依照转录组拼接序列设计引物的，目标条带1000bp，应该不存在你说的问题。。...

Can you confirm that your primers designed were cross-intron? Therefore, you should use the genomic DNA as the template for a positive test.
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4楼2016-01-11 21:08:55
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