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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[求助] 荧光定量,ABI的机子、用的染料,扩增曲线和熔解曲线怎么成了这个样子已有2人参与

前期摸索中,普通PCR温度梯度60℃。
模板试过稀释了5倍和10倍,20ul体系,95℃5min,95℃10s,60℃ 10s,72℃ 15s,40个循环。
荧光定量产物电泳条带为目的条带,使用过八连管,染料是罗氏的。

荧光定量,ABI的机子、用的染料,扩增曲线和熔解曲线怎么成了这个样子
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荧光定量,ABI的机子、用的染料,扩增曲线和熔解曲线怎么成了这个样子-1
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荧光定量,ABI的机子、用的染料,扩增曲线和熔解曲线怎么成了这个样子-2
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荧光定量,ABI的机子、用的染料,扩增曲线和熔解曲线怎么成了这个样子-3
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

别沉啊,求大神啊
3楼2015-12-15 10:26:47
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

管子问题?染料问题?体系问题?模板问题?操作问题?
4楼2015-12-15 10:31:03
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by GuanwenQ at 2015-12-15 10:40:01
说一下点的样呗

10ul mix  ,7ul dd水  ,2ul cDNA ,各0.5引物
8楼2015-12-15 10:51:54
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by GuanwenQ at 2015-12-15 10:50:24
还有这个循环的时间似乎有点短,我自己做通常退火和延伸时间在30s~60s

感觉这个时间,体现不出荧光定量机子相对于普通PCR的优越性。。。。原来用过罗氏480的,也是这个时间可以的。
9楼2015-12-15 10:53:35
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by GuanwenQ at 2015-12-15 10:41:24
你的引物是自己设计的还是买的
...

自己设计的,然后跑温度梯度,筛选出来的
10楼2015-12-15 10:54:33
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

大神在哪里~~
13楼2015-12-15 14:44:18
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by GuanwenQ at 2015-12-15 11:03:28
熔解曲线的特异性很低,也就是扩增产物不单一,那么可能是引物设计的特异性不好,cycle没有跑好,还有就是cDNA降解,cycle的话要不然就是酶量问题,要不然就是cycle的周期扩增曲线不平滑,也就是有样品没有没有参与 ...

但是我用产物跑电泳,条带也只有一个啊,我的产物大小在200bp左右,唯一就是电泳的条带有点宽。。。
14楼2015-12-15 16:02:14
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 文萱 at 2015-12-15 12:35:09
引物不特异

跑普通PCR的时候,感觉引物特异性还行啊
15楼2015-12-15 16:02:57
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 文萱 at 2015-12-15 16:07:17
荧光定量引物跟普通pcr引物不一样的,跑的条件也不一样。荧光定量比普通pcr更灵敏,你初步试的时候就要在荧光定量pcr仪上试,你根据这次结果再调整下温度,时间等等,有的时候不是一次就好的,
...

好的,我在优化下条件
17楼2015-12-15 16:10:32
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