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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

[求助] 荧光定量,ABI的机子、用的染料,扩增曲线和熔解曲线怎么成了这个样子已有2人参与

前期摸索中,普通PCR温度梯度60℃。
模板试过稀释了5倍和10倍,20ul体系,95℃5min,95℃10s,60℃ 10s,72℃ 15s,40个循环。
荧光定量产物电泳条带为目的条带,使用过八连管,染料是罗氏的。

荧光定量,ABI的机子、用的染料,扩增曲线和熔解曲线怎么成了这个样子
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

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18楼: Originally posted by GuanwenQ at 2015-12-15 16:11:15
如果电泳条带比较单一,那扩增产物可能是长度类似但是CG含量不单一的片段,那么这样看来或许是引物设计的特异性问题

难道前面不平滑的部分都是别的片段么
20楼2015-12-15 17:11:07
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
19楼: Originally posted by GuanwenQ at 2015-12-15 16:12:27
听说有些定量PCR试剂盒挑机子,不知道你这个有没有这种问题

我感觉应该会吧,我也不清楚。。。在这个机子上我看别人做的探针就挺好,而且人家用的是配套的
21楼2015-12-15 17:11:32
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
22楼: Originally posted by GuanwenQ at 2015-12-15 21:29:34
理论上说,熔解曲线出一个峰就是一种产物
...

我突然发现,人家跑ABI机器的板子,pcr管子比我大多了。。。
23楼2015-12-16 09:37:07
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

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24楼: Originally posted by 小-丑鱼 at 2015-12-16 12:18:53
应该是StepOne Plus跑的,你用的就是配套的HRM软件。
以经验来看,如果电泳验证没问题但HRM图不对的话,可能要调整下HRM的程序,尤其是升温速率,它的最大最小值跨度很大,可以试一试。
另外它有配套的染料,可以 ...

我看在这个机子上有人用TAKARA的额、染料跑过,效果也不行。我今天又跑了一次,加了模板量,升高了退火温度。。。还是这样
荧光定量,ABI的机子、用的染料,扩增曲线和熔解曲线怎么成了这个样子-4
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荧光定量,ABI的机子、用的染料,扩增曲线和熔解曲线怎么成了这个样子-5
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25楼2015-12-17 14:17:03
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