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将引物加上酶切位点问题 已有2人参与
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最近在构建表达载体，确定酶切成功了但是连接不上，我是将质粒双酶切，再将含酶切位点的引物P出目的片段，将这两个相连。我现在怀疑是不是我引物加酶切位点时弄错了？这个加了酶切位点的引物是能p出目的片段的，是否是酶切位点加错了？ 未加位点的序列：1-F: 5'AGTTCCAGCATACCATACACCC 1-R: 5'TCGCAGCCACAGTTTAGATAG 加了酶切位点：1-F-SpeI： 5’ GGACTAGT AGTTCCAGCATACCATACACCC 2-R-HindIII: 5‘ CCCAAGCTT TCGCAGCCACAGTTTAGATAG 做了好久了，求各位高手指点！ 连接体系 takara T4 ：1 ul 10*buffer：1 ul 目的片段：0.3 pmol 载体片段：0.03 pmol ddH2O: up to 10ul 16℃过夜连接（12-14h） 做了两个月了  |
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a86052
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2楼2015-12-11 16:28:38
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-18 23:00:00
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-18 23:00:00
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目的片段pcr完是带走保护碱基的平末端，不能直接连接，要通过相应的双酶切后出现粘性末端，才可以和载体连接 发自小木虫Android客户端 |
4楼2016-01-16 07:59:09
5楼2016-01-18 19:46:21
6楼2016-01-18 19:47:46
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-01-18 23:00:19
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-01-18 23:00:19
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PCR引物虽然添加了酶切位点，但是PCR产物的两端酶切位点是平末端的，不可以直接连接的(T载体克隆以及一些平末端的酶例外)，就像你的载体上含有酶切位点一样，你也需要用酶切去处理的，这样才能暴露出你选择的酶的粘性末端，当你的载体遇到相同酶处理过的目的基因时候，就可以识别那段粘性末端的序列，这样互补扣在一起，再在连接酶的作用下完成最后的缝补任务。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2016-01-18 19:59:37
8楼2016-01-18 20:04:31
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Joyceyuan: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2016-01-18 20:46:26
Joyceyuan: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2016-01-18 20:46:26
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这个要看你的产物扩增的浓度了，一般特异性较好的产物，我们通常可以50微升产物在100微升的酶切体系，酶切时间跟你们用的酶有关系吧，不过建议PCR仅物酶切时尽量比载体时间长一些，因为它仅紧靠几个保护碱基来让酶剪切，效率相对会低些，最后酶切完后，如果条带特异性好的可以直接过柱纯化，如果特异性不好，建议PCR后先胶回收目的条带后再酶切。 发自小木虫Android客户端 |
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Joyceyuan9楼2016-01-18 20:16:12
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