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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 3906788
注册: 2015-06-03
专业: 植物化学保护

[求助] 将引物加上酶切位点问题已有2人参与

最近在构建表达载体，确定酶切成功了但是连接不上，我是将质粒双酶切，再将含酶切位点的引物P出目的片段，将这两个相连。我现在怀疑是不是我引物加酶切位点时弄错了？这个加了酶切位点的引物是能p出目的片段的，是否是酶切位点加错了？
未加位点的序列：1-F: 5'AGTTCCAGCATACCATACACCC
                        1-R: 5'TCGCAGCCACAGTTTAGATAG
加了酶切位点：1-F-SpeI： 5’ GGACTAGT  AGTTCCAGCATACCATACACCC
                     2-R-HindIII: 5‘ CCCAAGCTT  TCGCAGCCACAGTTTAGATAG
做了好久了，求各位高手指点！
连接体系
takara T4 ：1 ul
10*buffer：1 ul
目的片段：0.3 pmol
载体片段：0.03 pmol
ddH2O:    up to 10ul
16℃过夜连接（12-14h）
做了两个月了

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1楼 2015-12-11 14:22:46

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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

7楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-01-18 19:59:37
PCR引物虽然添加了酶切位点，但是PCR产物的两端酶切位点是平末端的，不可以直接连接的(T载体克隆以及一些平末端的酶例外)，就像你的载体上含有酶切位点一样，你也需要用酶切去处理的，这样才能暴露出你选择的酶的粘 ...

多谢！！！还想请问下如果我PCR产物双酶切的话酶切体系和载体的酶切体系一样么？酶切时间也和载体一样么？