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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)

[求助] 将引物加上酶切位点问题 已有2人参与

最近在构建表达载体，确定酶切成功了但是连接不上，我是将质粒双酶切，再将含酶切位点的引物P出目的片段，将这两个相连。我现在怀疑是不是我引物加酶切位点时弄错了？这个加了酶切位点的引物是能p出目的片段的，是否是酶切位点加错了？
未加位点的序列：1-F: 5'AGTTCCAGCATACCATACACCC
                            1-R: 5'TCGCAGCCACAGTTTAGATAG
加了酶切位点：1-F-SpeI： 5’ GGACTAGT  AGTTCCAGCATACCATACACCC
                        2-R-HindIII: 5‘ CCCAAGCTT  TCGCAGCCACAGTTTAGATAG
做了好久了，求各位高手指点！
连接体系
takara T4 ：1 ul
10*buffer：1 ul
目的片段：0.3 pmol
载体片段：0.03 pmol
ddH2O:     up to 10ul
16℃过夜连接（12-14h）
做了两个月了
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1楼 2015-12-11 14:22:46
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的目的片段双酶切了没有？
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2楼2015-12-11 16:28:38
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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-12-11 16:28:38
你的目的片段双酶切了没有？

目的片段是PCR产物
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3楼2016-01-16 00:15:59
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-18 23:00:00
目的片段pcr完是带走保护碱基的平末端，不能直接连接，要通过相应的双酶切后出现粘性末端，才可以和载体连接

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
4楼2016-01-16 07:59:09
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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-01-16 07:59:09
目的片段pcr完是带走保护碱基的平末端，不能直接连接，要通过相应的双酶切后出现粘性末端，才可以和载体连接

你好，用加了酶切位点的引物，进行PCR的产物也不行么？还需要对这个PCR产物进行酶切？
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5楼2016-01-18 19:46:21
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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-01-16 07:59:09
目的片段pcr完是带走保护碱基的平末端，不能直接连接，要通过相应的双酶切后出现粘性末端，才可以和载体连接

我看一般情况下酶切连接的说明，不都是载体酶切纯化，PCR采用含酶切位点的引物，纯化后的PCR产物直接连接么？难道我理解错了？新手求解答
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6楼2016-01-18 19:47:46
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-01-18 23:00:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by Joyceyuan at 2016-01-18 19:47:46
我看一般情况下酶切连接的说明，不都是载体酶切纯化，PCR采用含酶切位点的引物，纯化后的PCR产物直接连接么？难道我理解错了？新手求解答...

PCR引物虽然添加了酶切位点，但是PCR产物的两端酶切位点是平末端的，不可以直接连接的(T载体克隆以及一些平末端的酶例外)，就像你的载体上含有酶切位点一样，你也需要用酶切去处理的，这样才能暴露出你选择的酶的粘性末端，当你的载体遇到相同酶处理过的目的基因时候，就可以识别那段粘性末端的序列，这样互补扣在一起，再在连接酶的作用下完成最后的缝补任务。

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7楼2016-01-18 19:59:37
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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-01-18 19:59:37
PCR引物虽然添加了酶切位点，但是PCR产物的两端酶切位点是平末端的，不可以直接连接的(T载体克隆以及一些平末端的酶例外)，就像你的载体上含有酶切位点一样，你也需要用酶切去处理的，这样才能暴露出你选择的酶的粘 ...

多谢！！！还想请问下如果我PCR产物双酶切的话酶切体系和载体的酶切体系一样么？酶切时间也和载体一样么？
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8楼2016-01-18 20:04:31
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
Joyceyuan: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2016-01-18 20:46:26
这个要看你的产物扩增的浓度了，一般特异性较好的产物，我们通常可以50微升产物在100微升的酶切体系，酶切时间跟你们用的酶有关系吧，不过建议PCR仅物酶切时尽量比载体时间长一些，因为它仅紧靠几个保护碱基来让酶剪切，效率相对会低些，最后酶切完后，如果条带特异性好的可以直接过柱纯化，如果特异性不好，建议PCR后先胶回收目的条带后再酶切。

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Joyceyuan
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9楼2016-01-18 20:16:12
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Joyceyuan

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-01-18 20:16:12
这个要看你的产物扩增的浓度了，一般特异性较好的产物，我们通常可以50微升产物在100微升的酶切体系，酶切时间跟你们用的酶有关系吧，不过建议PCR仅物酶切时尽量比载体时间长一些，因为它仅紧靠几个保护碱基来让酶剪 ...

突然就有希望了，谢谢谢谢！
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10楼2016-01-18 20:46:17
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