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寒心季

新虫 (初入文坛)

[求助] 求大神分析定量结果,为什么会这样? 已有1人参与

模板稀释10倍,浸泡dsRNA后提取RNA再反转录的。数据部分是一片空白。上图。

求大神分析定量结果,为什么会这样?
扩增曲线.png


求大神分析定量结果,为什么会这样?-1
熔解曲线.png


求大神分析定量结果,为什么会这样?-2
3.png


求大神分析定量结果,为什么会这样?-3
稀释10倍的模板跑的普通PCR用的普通引物.jpg
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草溪河

铁虫 (著名写手)

定量没扩出来,唯一一个可能扩出来的但是溶解温度有点小,怀疑是引物二聚体。扩增片段多大呀?

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2楼2015-11-20 19:56:18
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寒心季

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 草溪河 at 2015-11-20 19:56:18
定量没扩出来,唯一一个可能扩出来的但是溶解温度有点小,怀疑是引物二聚体。扩增片段多大呀?

大神能解释下为啥会这样吗?片段是500度bp的,可能扩出来的那个是Actin
3楼2015-11-20 21:16:24
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liukai123

新虫 (小有名气)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-21 22:55:59
你用的2000的marker,我怎么也看不出来你扩的带是500bp啊,说明就没扩增出来,而且样品不纯有污染,断断续续的?

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4楼2015-11-20 22:04:55
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草溪河

铁虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
寒心季: 金币+10, 有帮助 2015-11-21 20:21:14
引用回帖:
3楼: Originally posted by 寒心季 at 2015-11-20 21:16:24
大神能解释下为啥会这样吗?片段是500度bp的,可能扩出来的那个是Actin...

在机子上可以看出有溶解曲线的样品是哪一个。实时荧光定量引物的产物大小一般100-250bp,不能太大。定量引物设计原则可以在百度搜索出来。相同的pcr体系,普通pcr可以,但定量未必就行,因为定量中加的染料对pcr有一定的抑制作用,染料用量要适当。
5楼2015-11-20 23:49:09
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寒心季

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 草溪河 at 2015-11-20 23:49:09
在机子上可以看出有溶解曲线的样品是哪一个。实时荧光定量引物的产物大小一般100-250bp,不能太大。定量引物设计原则可以在百度搜索出来。相同的pcr体系,普通pcr可以,但定量未必就行,因为定量中加的染料对pcr有 ...

好吧,我说详细一点,做这个定量是用来检测浸泡后基因表达量是否下调的。跑的电泳图用的是普通引物和普通程序的PCR就是为了看看这几个模板能不能用。引物是小老板设计的,片段是大于500b的(在普通PCR上),染料加了10微升,也是根据说明书来的,貌似我们实验室都是加10微升,至于样品污染是指什么呢?反转录后取了部分稀释。
6楼2015-11-21 20:20:17
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liukai123

新虫 (小有名气)

反转录的时间是最容易污染的时间,样品不纯,转过来也没有用的。

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7楼2015-11-21 22:55:12
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草溪河

铁虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 寒心季 at 2015-11-21 20:20:17
好吧,我说详细一点,做这个定量是用来检测浸泡后基因表达量是否下调的。跑的电泳图用的是普通引物和普通程序的PCR就是为了看看这几个模板能不能用。引物是小老板设计的,片段是大于500b的(在普通PCR上),染料加 ...

那很简单,直接将结果反馈给老师,看哪儿出问题,也可及时调整。

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8楼2015-11-21 23:32:51
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草溪河

铁虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 寒心季 at 2015-11-21 20:20:17
好吧,我说详细一点,做这个定量是用来检测浸泡后基因表达量是否下调的。跑的电泳图用的是普通引物和普通程序的PCR就是为了看看这几个模板能不能用。引物是小老板设计的,片段是大于500b的(在普通PCR上),染料加 ...

设计的引物扩不出来也很正常的

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9楼2015-11-21 23:33:18
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寒心季

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by liukai123 at 2015-11-21 22:55:12
反转录的时间是最容易污染的时间,样品不纯,转过来也没有用的。

真的吗?不要吓我。。。
10楼2015-11-22 09:19:50
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