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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量求大神赐教~~~
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linsui1989

新虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量求大神赐教~~~

我最近用RNA做标准品在建标准曲线，用的是一步法RT-PCR方法，两次做出来的曲线都很凌乱，附图两张，求分析解释。根据分光光度计的结果显示标准品原液浓度大约是10的12次方个copies，260/280=2.00, 260/230=1.69, 求分析解释。
荧光定量求大神赐教~~~
sample2(1).sds_AmpPlot.jpg


荧光定量求大神赐教~~~-1
sample2(2).sds_AmpPlot.jpg
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1楼 2013-11-21 16:23:58
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zzl2516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-21 16:57:15
一步法是什么方法。。。从来没用过一步法。。就图形来看你这个扩增曲线都没有到平台期，现在不都是用两步法或三步法么，建议改为两步法
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2楼2013-11-21 16:49:06
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的凌乱是指你各个梯度的重复做的不好还是什么？
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3楼2013-11-21 16:58:20
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linsui1989

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by love_st at 2013-11-21 16:58:20
你的凌乱是指你各个梯度的重复做的不好还是什么？

我是10倍梯度稀释的标准品，从10的10次方开始加样，不仅重复性不好，而且PCR起峰很晚，尤其是第二张图，起峰时间都集中在后半段，根本没有梯度间的差别。
我之前建的另一个种病毒RNA的标准曲线就很稳定，（附图），实在找不出其中的原因
荧光定量求大神赐教~~~-2
lin10.24。正式.sds_AmpPlot.jpg
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4楼2013-11-21 19:07:25
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2013-11-22 16:40:53
引用回帖:
4楼: Originally posted by linsui1989 at 2013-11-21 19:07:25
我是10倍梯度稀释的标准品，从10的10次方开始加样，不仅重复性不好，而且PCR起峰很晚，尤其是第二张图，起峰时间都集中在后半段，根本没有梯度间的差别。
我之前建的另一个种病毒RNA的标准曲线就很稳定，（附图） ...

1.你的最高浓度如果是10次方的话，Ct值是偏大了点，这个可能和你引物探针扩增效率有关系，还有你的重复性不好，低浓度扩增不好，可能和你体系有关系，试着去优化下体系，调整下各试剂组份浓度，特别是你所用的酶，即使同样的酶，对于不同体系它的比例也不尽相同，都去做些许调整吧，可能会取得好的结果。
2.重复性不好除了体系的问题，很多时候是操作者的操作手法等问题，请相信，虽然PCR是个相对简单的实验，但是想做好并不是简单的事情，一两次的实验不能说明任何问题。
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5楼2013-11-22 09:09:29
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vege的桌子

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 16:41:00
会不会是PCR产物的污染，导致在高浓度模板上影响不大，在低浓度模板时有异性，建议处理一下实验室，换一批新原料再检测
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6楼2013-11-22 11:00:28
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linsui1989

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by vege的桌子 at 2013-11-22 11:00:28
会不会是PCR产物的污染，导致在高浓度模板上影响不大，在低浓度模板时有异性，建议处理一下实验室，换一批新原料再检测

高浓度模板影响也挺大的，10的10次方copies的模板CT值在17,和正常的也差了不少
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7楼2013-11-22 15:00:25
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