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linsui1989

新虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量求大神赐教~~~

我最近用RNA做标准品在建标准曲线,用的是一步法RT-PCR方法,两次做出来的曲线都很凌乱,附图两张,求分析解释。根据分光光度计的结果显示标准品原液浓度大约是10的12次方个copies,260/280=2.00, 260/230=1.69, 求分析解释。
荧光定量求大神赐教~~~
sample2(1).sds_AmpPlot.jpg


荧光定量求大神赐教~~~-1
sample2(2).sds_AmpPlot.jpg
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zzl2516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-11-21 16:57:15
一步法是什么方法。。。从来没用过一步法。。就图形来看你这个扩增曲线都没有到平台期,现在不都是用两步法或三步法么,建议改为两步法
2楼2013-11-21 16:49:06
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的凌乱是指你各个梯度的重复做的不好还是什么?
3楼2013-11-21 16:58:20
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linsui1989

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by love_st at 2013-11-21 16:58:20
你的凌乱是指你各个梯度的重复做的不好还是什么?

我是10倍梯度稀释的标准品,从10的10次方开始加样,不仅重复性不好,而且PCR起峰很晚,尤其是第二张图,起峰时间都集中在后半段,根本没有梯度间的差别。
我之前建的另一个种病毒RNA的标准曲线就很稳定,(附图),实在找不出其中的原因
荧光定量求大神赐教~~~-2
lin10.24。正式.sds_AmpPlot.jpg

4楼2013-11-21 19:07:25
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励交流! 2013-11-22 16:40:53
引用回帖:
4楼: Originally posted by linsui1989 at 2013-11-21 19:07:25
我是10倍梯度稀释的标准品,从10的10次方开始加样,不仅重复性不好,而且PCR起峰很晚,尤其是第二张图,起峰时间都集中在后半段,根本没有梯度间的差别。
我之前建的另一个种病毒RNA的标准曲线就很稳定,(附图) ...

1.你的最高浓度如果是10次方的话,Ct值是偏大了点,这个可能和你引物探针扩增效率有关系,还有你的重复性不好,低浓度扩增不好,可能和你体系有关系,试着去优化下体系,调整下各试剂组份浓度,特别是你所用的酶,即使同样的酶,对于不同体系它的比例也不尽相同,都去做些许调整吧,可能会取得好的结果。
2.重复性不好除了体系的问题,很多时候是操作者的操作手法等问题,请相信,虽然PCR是个相对简单的实验,但是想做好并不是简单的事情,一两次的实验不能说明任何问题。
5楼2013-11-22 09:09:29
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vege的桌子

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-22 16:41:00
会不会是PCR产物的污染,导致在高浓度模板上影响不大,在低浓度模板时有异性,建议处理一下实验室,换一批新原料再检测
6楼2013-11-22 11:00:28
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linsui1989

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by vege的桌子 at 2013-11-22 11:00:28
会不会是PCR产物的污染,导致在高浓度模板上影响不大,在低浓度模板时有异性,建议处理一下实验室,换一批新原料再检测

高浓度模板影响也挺大的,10的10次方copies的模板CT值在17,和正常的也差了不少
7楼2013-11-22 15:00:25
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