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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求大神分析定量结果，为什么会这样？
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寒心季

新虫 (初入文坛)

[求助] 求大神分析定量结果，为什么会这样？ 已有1人参与

模板稀释10倍，浸泡dsRNA后提取RNA再反转录的。数据部分是一片空白。上图。

求大神分析定量结果，为什么会这样？
扩增曲线.png


求大神分析定量结果，为什么会这样？-1
熔解曲线.png


求大神分析定量结果，为什么会这样？-2
3.png


求大神分析定量结果，为什么会这样？-3
稀释10倍的模板跑的普通PCR用的普通引物.jpg
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1楼 2015-11-20 19:16:43
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草溪河

铁虫 (著名写手)
定量没扩出来，唯一一个可能扩出来的但是溶解温度有点小，怀疑是引物二聚体。扩增片段多大呀？

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2楼2015-11-20 19:56:18
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寒心季

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 草溪河 at 2015-11-20 19:56:18
定量没扩出来，唯一一个可能扩出来的但是溶解温度有点小，怀疑是引物二聚体。扩增片段多大呀？

大神能解释下为啥会这样吗？片段是500度bp的，可能扩出来的那个是Actin
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3楼2015-11-20 21:16:24
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liukai123

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-21 22:55:59
你用的2000的marker，我怎么也看不出来你扩的带是500bp啊，说明就没扩增出来，而且样品不纯有污染，断断续续的？

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4楼2015-11-20 22:04:55
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草溪河

铁虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
寒心季: 金币+10, ★有帮助 2015-11-21 20:21:14
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3楼: Originally posted by 寒心季 at 2015-11-20 21:16:24
大神能解释下为啥会这样吗？片段是500度bp的，可能扩出来的那个是Actin...

在机子上可以看出有溶解曲线的样品是哪一个。实时荧光定量引物的产物大小一般100-250bp，不能太大。定量引物设计原则可以在百度搜索出来。相同的pcr体系，普通pcr可以，但定量未必就行，因为定量中加的染料对pcr有一定的抑制作用，染料用量要适当。
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5楼2015-11-20 23:49:09
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寒心季

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 草溪河 at 2015-11-20 23:49:09
在机子上可以看出有溶解曲线的样品是哪一个。实时荧光定量引物的产物大小一般100-250bp，不能太大。定量引物设计原则可以在百度搜索出来。相同的pcr体系，普通pcr可以，但定量未必就行，因为定量中加的染料对pcr有 ...

好吧，我说详细一点，做这个定量是用来检测浸泡后基因表达量是否下调的。跑的电泳图用的是普通引物和普通程序的PCR就是为了看看这几个模板能不能用。引物是小老板设计的，片段是大于500b的（在普通PCR上），染料加了10微升，也是根据说明书来的，貌似我们实验室都是加10微升，至于样品污染是指什么呢？反转录后取了部分稀释。
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6楼2015-11-21 20:20:17
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liukai123

新虫 (小有名气)
反转录的时间是最容易污染的时间，样品不纯，转过来也没有用的。

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7楼2015-11-21 22:55:12
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草溪河

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 寒心季 at 2015-11-21 20:20:17
好吧，我说详细一点，做这个定量是用来检测浸泡后基因表达量是否下调的。跑的电泳图用的是普通引物和普通程序的PCR就是为了看看这几个模板能不能用。引物是小老板设计的，片段是大于500b的（在普通PCR上），染料加 ...

那很简单，直接将结果反馈给老师，看哪儿出问题，也可及时调整。

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8楼2015-11-21 23:32:51
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草溪河

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 寒心季 at 2015-11-21 20:20:17
好吧，我说详细一点，做这个定量是用来检测浸泡后基因表达量是否下调的。跑的电泳图用的是普通引物和普通程序的PCR就是为了看看这几个模板能不能用。引物是小老板设计的，片段是大于500b的（在普通PCR上），染料加 ...

设计的引物扩不出来也很正常的

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9楼2015-11-21 23:33:18
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寒心季

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liukai123 at 2015-11-21 22:55:12
反转录的时间是最容易污染的时间，样品不纯，转过来也没有用的。

真的吗？不要吓我。。。
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10楼2015-11-22 09:19:50
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