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z631535213

木虫 (正式写手)

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[求助] PCR后i电泳没目的条带，求助啊已有5人参与

买的市面上某根的KIT，取的体系是25ul：12.5ul PCR MIX ，5ul 模版，1ul 前引（10uM），1ul后引（10uM），加dd水至25ul
设置的是 94° 3min，（94° 30s，55° 30s，72° 30s）20cycles ，72° 5min。
跑胶是3%的琼脂糖 60ml，5ul Mark。先是80V 20min，然后120V至结束

想请问下：
1.上面的设置有没有哪些不合理的啊？
2.跑到Mark之前的是不是引物啊？Mark最下面那个是50bp的，Mark加了5ul/琼脂糖60ml，是不是少加点好？
3.是不是进行一下梯度PCR来确定下退火温度啊？

2.jpg

IMG_0604.JPG

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1楼2015-11-19 08:16:57

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liping121200

铜虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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z631535213: 金币+8, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2015-11-19 16:08:15

1、引物加1uL可以的，你的模板加的有点多，一般也是加1uL就够了，但要根据你的浓度
2、你的循环数少了点，一般30-35个循环，你才20个
3、你的胶浓度过高，一般0.5%-1%就可以了
4、你的marker 点的太多，一般点2-3uL就可以
5、你跑DNA产物，不用弄得这么麻烦，80v的电压跑的太慢了，你可以直接调到110-120v的电压，跑30分钟左右就很好了
6、你跑出来的东西基本上就不是你的目的条带，可以设置个温度梯度跑跑看