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z631535213木虫 (正式写手)
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PCR后i电泳没目的条带， 求助啊已有5人参与
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买的市面上某根的KIT，取的体系是25ul：12.5ul PCR MIX ，5ul 模版，1ul 前引 （10uM） ，1ul后引（10uM），加dd水至25ul 设置的是 94° 3min， （94° 30s，55° 30s，72° 30s）20cycles ，72° 5min。 跑胶是3%的琼脂糖 60ml，5ul Mark。先是80V 20min，然后120V至结束 想请问下： 1.上面的设置有没有哪些不合理的啊？ 2.跑到Mark之前的是不是引物啊？Mark最下面那个是50bp的，Mark加了5ul/琼脂糖60ml，是不是少加点好？ 3.是不是进行一下梯度PCR来确定下退火温度啊？  2.jpg  IMG_0604.JPG |
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【答案】应助回帖
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z631535213: 金币+8, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2015-11-19 16:08:15
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1、引物加1uL可以的，你的模板加的有点多，一般也是加1uL就够了，但要根据你的浓度 2、你的循环数少了点，一般30-35个循环，你才20个 3、你的胶浓度过高，一般0.5%-1%就可以了 4、你的marker 点的太多，一般点2-3uL就可以 5、你跑DNA产物，不用弄得这么麻烦，80v的电压跑的太慢了，你可以直接调到110-120v的电压，跑30分钟左右就很好了 6、你跑出来的东西基本上就不是你的目的条带，可以设置个温度梯度跑跑看 |
9楼2015-11-19 14:10:35
liping121200
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5楼2015-11-19 10:45:33
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感觉没有特异条带，可以试试降低退货火温度，或者提高一下循环次数（我一般都是30循环）。感觉楼主的Mark好了亮哦，可少点一些不吧。 想问楼主为啥跑电源的时候还要改变电压啊？（我也刚开始做实验，我都说一个电压跑结束的） 发自小木虫Android客户端 |
6楼2015-11-19 11:19:37
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