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babysheep963

新虫 (初入文坛)

[交流] western blot经验求助

属性十成新小白，希望和大家探讨交流关于基础的WB实验经验。连续跑了三次，标准蛋白只可见一粒小点，胶片背景呈暗黑而不是正常的暗蓝色，想求证是否和抗体重复使用次数过多失活或者TBST浓度偏高有关？还是存在其他基本的问题？    大过节的已经蠢哭    请经过的列位大侠拉一把人群中我奋力举起的双手！

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1楼 2015-11-11 23:14:11
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liweiwaxmc

铜虫 (小有名气)
★
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
最好上图

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4楼2015-11-11 23:22:26
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乔丹希尔

金虫 (著名写手)
★
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
没有图 咋给你说
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12楼2015-11-11 23:49:59
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xiangruikong

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
内容已删除
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14楼2015-11-12 06:51:57
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
从你的描述上来看，感觉是背景过高。
可能的原因及建议
膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
做的是什么蛋白？是原核的重组表达蛋白么？最好还是把图放上来分析一下
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15楼2015-11-12 09:35:38
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agtc

至尊木虫 (著名写手)
胶片曝光了吧

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16楼2015-11-12 09:40:53
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喧闹

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也想知道~大神你在哪里？
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17楼2015-11-12 11:01:30
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babysheep963

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-11-12 09:35:38
从你的描述上来看，感觉是背景过高。
可能的原因及建议
膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
一抗孵育的温度偏高——建议 ...

谢谢！
嗯，首先保持膜湿润和一抗孵育温度是没问题的，只是我一抗稀释1000倍，回收重复使用了三次是否有影响。
100mlTBST+1%BSA封闭1h
洗涤用TBST：4.04g Nacl,6.6gTris定容至500ml
曝光时间5min,10min和30min都做过，最后用的30min
做的LC3蛋白
胶片左边是marker位置，左上角一小点预计为跑出的蛋白条带……
请赐教
western blot经验求助



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18楼2015-11-12 13:09:15
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babysheep963

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 乔丹希尔 at 2015-11-11 23:49:59
没有图 咋给你说

认为左上角一小点位置是跑出来的“条带”……   背景颜色实在太深……
请赐教
western blot经验求助-1



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19楼2015-11-12 13:12:00
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babysheep963

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by agtc at 2015-11-12 09:40:53
胶片曝光了吧

看结果曝光时间10-30min貌似都没问题啊，再长没试过了

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20楼2015-11-12 13:22:39
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乔丹希尔

金虫 (著名写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by babysheep963 at 2015-11-12 13:12:00
认为左上角一小点位置是跑出来的“条带”……   背景颜色实在太深……
请赐教

...

胶片曝光了？

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21楼2015-11-12 14:25:54
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babysheep963

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 乔丹希尔 at 2015-11-12 14:25:54
胶片曝光了？
...

确定没有曝光，我都快夜盲反应了……认为是一抗使用次数太多失活，或者应该加大稀释倍数，减少曝光时间。一个变量一个变量逐步来，敢问大侠的蛋白种类（磷酸话还是GA）？,曝光时间范围？封闭液配方和封闭时间？严重感谢

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22楼2015-11-12 14:31:20
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wc2896920

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也同样做不出，祝福楼主

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23楼2015-11-12 14:57:05
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syhorchid2楼
2015-11-11 23:14   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
zhuguiqiu3楼
2015-11-11 23:20   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
哦 ！
longwave5楼
2015-11-11 23:28   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫Android客户端
dmbb6楼
2015-11-11 23:28   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
白雪飞扬7楼
2015-11-11 23:33   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
尘轩无梦8楼
2015-11-11 23:34   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
， [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
小鱼儿3129楼
2015-11-11 23:39   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
billie11310楼
2015-11-11 23:45   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
billie11311楼
2015-11-11 23:46   回复  
shenrenren13楼
2015-11-12 06:24   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
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