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babysheep963

新虫 (初入文坛)

[交流] western blot经验求助

属性十成新小白，希望和大家探讨交流关于基础的WB实验经验。连续跑了三次，标准蛋白只可见一粒小点，胶片背景呈暗黑而不是正常的暗蓝色，想求证是否和抗体重复使用次数过多失活或者TBST浓度偏高有关？还是存在其他基本的问题？    大过节的已经蠢哭    请经过的列位大侠拉一把人群中我奋力举起的双手！

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1楼 2015-11-11 23:14:11
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babysheep963

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-11-12 09:35:38
从你的描述上来看，感觉是背景过高。
可能的原因及建议
膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
一抗孵育的温度偏高——建议 ...

谢谢！
嗯，首先保持膜湿润和一抗孵育温度是没问题的，只是我一抗稀释1000倍，回收重复使用了三次是否有影响。
100mlTBST+1%BSA封闭1h
洗涤用TBST：4.04g Nacl,6.6gTris定容至500ml
曝光时间5min,10min和30min都做过，最后用的30min
做的LC3蛋白
胶片左边是marker位置，左上角一小点预计为跑出的蛋白条带……
请赐教
western blot经验求助



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18楼2015-11-12 13:09:15
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liweiwaxmc

铜虫 (小有名气)
★
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
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4楼2015-11-11 23:22:26
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longwave5楼
2015-11-11 23:28   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫Android客户端
白雪飞扬7楼
2015-11-11 23:33   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
尘轩无梦8楼
2015-11-11 23:34   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
， [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
小鱼儿3129楼
2015-11-11 23:39   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
billie11310楼
2015-11-11 23:45   回复  
babysheep963(金币+1): 谢谢参与
billie11311楼
2015-11-11 23:46   回复  
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