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babysheep963

新虫 (初入文坛)

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[交流] western blot经验求助

属性十成新小白，希望和大家探讨交流关于基础的WB实验经验。连续跑了三次，标准蛋白只可见一粒小点，胶片背景呈暗黑而不是正常的暗蓝色，想求证是否和抗体重复使用次数过多失活或者TBST浓度偏高有关？还是存在其他基本的问题？大过节的已经蠢哭请经过的列位大侠拉一把人群中我奋力举起的双手！

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1楼 2015-11-11 23:14:11

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babysheep963

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引用回帖:

15楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-11-12 09:35:38
从你的描述上来看，感觉是背景过高。
可能的原因及建议
膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
一抗孵育的温度偏高——建议 ...

谢谢！
嗯，首先保持膜湿润和一抗孵育温度是没问题的，只是我一抗稀释1000倍，回收重复使用了三次是否有影响。
100mlTBST+1%BSA封闭1h
洗涤用TBST：4.04g Nacl,6.6gTris定容至500ml
曝光时间5min,10min和30min都做过，最后用的30min
做的LC3蛋白
胶片左边是marker位置，左上角一小点预计为跑出的蛋白条带……
请赐教