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babysheep963

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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[交流] western blot经验求助

属性十成新小白，希望和大家探讨交流关于基础的WB实验经验。连续跑了三次，标准蛋白只可见一粒小点，胶片背景呈暗黑而不是正常的暗蓝色，想求证是否和抗体重复使用次数过多失活或者TBST浓度偏高有关？还是存在其他基本的问题？大过节的已经蠢哭请经过的列位大侠拉一把人群中我奋力举起的双手！

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1楼2015-11-11 23:14:11

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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

应助: 110 (高中生)
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★
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从你的描述上来看，感觉是背景过高。
可能的原因及建议
膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
做的是什么蛋白？是原核的重组表达蛋白么？最好还是把图放上来分析一下