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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 标曲溶解曲线单一峰，但梯度稀释后，Ct值基本无差别，线性很差，扩增效率高的吓人
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二月smile

新虫 (初入文坛)

[求助] 标曲溶解曲线单一峰，但梯度稀释后，Ct值基本无差别，线性很差，扩增效率高的吓人 已有1人参与

如图，不知道是怎么回事啊，理论上，不同梯度的浓度的质粒的Ct值是有差别的，可以分开的啊。我做的另一个基因是可以分开的，为什么这个的Ct值都在一起呢。我是按1ul+9ul稀释的。扩增条件是：94℃预变性4min，45个循环为94℃变性45s，61℃退火45s,72℃延1min，最后再在72℃延伸20min。体系是：引物10uM各 1ul，mix12.5，双蒸水10，模板1ul（10ng/ul）.    新手求助！急！！急！！急！！

标曲溶解曲线单一峰，但梯度稀释后，Ct值基本无差别，线性很差，扩增效率高的吓人
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标曲溶解曲线单一峰，但梯度稀释后，Ct值基本无差别，线性很差，扩增效率高的吓人-1
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标曲溶解曲线单一峰，但梯度稀释后，Ct值基本无差别，线性很差，扩增效率高的吓人-2
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1楼 2015-11-05 11:00:13
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

二月smile

新虫 (初入文坛)
是质粒没有稀释开吗？
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2楼2015-11-05 15:26:52
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wjf7862203

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 二月smile at 2015-11-05 16:32:36
楼主，我还想问一个问题。我样品的平行间也不好，是有些基因本身就不好稀释混匀吗？还是其他原因。...

基因连到质粒，质粒作为阳性模板，一般都可以稀释开的，我一般一直稀释到10的1次方，还有质粒比较容易污染，稀释时要注意，

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9楼2015-11-05 19:16:05
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普通回帖

二月smile

新虫 (初入文坛)
在线等，急啊。导师快没耐心了，跟样品一起做了两次失败了，然后做标曲，又失败了。浪费了很多药品，还是没找到原因，不敢再试了。大神们，快快帮帮我。
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3楼2015-11-05 15:32:42
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wjf7862203

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
二月smile: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-11-05 16:41:50
没有稀释好，标准曲线，稀释很关键，稀释好就是成功一半了。1ul+9ul稀释很不好稀释，量太少了，建议你加大稀释体积20ul+180ul。稀释时注意混匀，枪头用进口的吸的准一些，稀释液可以考虑用TE

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4楼2015-11-05 15:59:22
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二月smile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wjf7862203 at 2015-11-05 15:59:22
没有稀释好，标准曲线，稀释很关键，稀释好就是成功一半了。1ul+9ul稀释很不好稀释，量太少了，建议你加大稀释体积20ul+180ul。稀释时注意混匀，枪头用进口的吸的准一些，稀释液可以考虑用TE
...

楼主，我还想问一个问题。我样品的平行间也不好，是有些基因本身就不好稀释混匀吗？还是其他原因。
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5楼2015-11-05 16:32:36
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二月smile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wjf7862203 at 2015-11-05 15:59:22
没有稀释好，标准曲线，稀释很关键，稀释好就是成功一半了。1ul+9ul稀释很不好稀释，量太少了，建议你加大稀释体积20ul+180ul。稀释时注意混匀，枪头用进口的吸的准一些，稀释液可以考虑用TE
...

我的质粒是10次方，有人建议我，1到1000稀释到7次方，然后100到1000逐级稀释6-3次方。这样可行吗？
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6楼2015-11-05 16:36:19
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upgo123

金虫 (小有名气)
我们做标曲是将模板稀释若干个梯度：-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8；取-3、-4、-5、-6四个梯度，两个平行做标曲，结果还可以，高浓度模板的CT值在18左右。不过我们用的染料是SYBR GREEN，不知道FAM是否适用。
另外，看你的扩增CT值还不低，是不是模板浓度本身就高，要不你以100为梯度稀释试试看
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选择，然后坚持
7楼2015-11-05 16:48:12
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许彦

木虫 (正式写手)
会不会存在强阳污染的问题，有没有阴性对照

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8楼2015-11-05 17:04:22
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wjf7862203

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 二月smile at 2015-11-05 16:36:19
我的质粒是10次方，有人建议我，1到1000稀释到7次方，然后100到1000逐级稀释6-3次方。这样可行吗？...

我一般在灵敏度的时候随便把标准曲线给做了，标准曲线一般取5个稀释度，10的2，3,4,5,6次方,

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10楼2015-11-05 19:20:31
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