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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 标曲溶解曲线单一峰，但梯度稀释后，Ct值基本无差别，线性很差，扩增效率高的吓人
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二月smile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wjf7862203 at 2015-11-05 19:16:05
基因连到质粒，质粒作为阳性模板，一般都可以稀释开的，我一般一直稀释到10的1次方，还有质粒比较容易污染，稀释时要注意，
...

质粒污染是什么意思？

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11楼2015-11-05 21:13:59
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二月smile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by upgo123 at 2015-11-05 16:48:12
我们做标曲是将模板稀释若干个梯度：-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8；取-3、-4、-5、-6四个梯度，两个平行做标曲，结果还可以，高浓度模板的CT值在18左右。不过我们用的染料是SYBR GREEN，不知道FAM是否适用。
另 ...

我们用的是同一种mix。很多都跟我说是没稀释开。今天晚上试了一下大体积稀释，正在跑，等结果出来看一下效果。

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12楼2015-11-05 21:17:39
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二月smile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 许彦 at 2015-11-05 17:04:22
会不会存在强阳污染的问题，有没有阴性对照

强阳污染指什么？

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13楼2015-11-05 21:18:43
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二月smile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 二月smile at 2015-11-05 21:18:43
强阳污染指什么？
...

没有阴性对照。。。

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14楼2015-11-05 21:19:26
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二月smile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wjf7862203 at 2015-11-05 15:59:22
没有稀释好，标准曲线，稀释很关键，稀释好就是成功一半了。1ul+9ul稀释很不好稀释，量太少了，建议你加大稀释体积20ul+180ul。稀释时注意混匀，枪头用进口的吸的准一些，稀释液可以考虑用TE
...

还有。你都是在超净台中操作的吗？一定要吗？如果是，涡旋离心是怎么操作的？

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15楼2015-11-05 21:22:31
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许彦

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 二月smile at 2015-11-05 21:19:26
没有阴性对照。。。
...

就是说这个是污染了。你被稀释的样本显示不出来。

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16楼2015-11-05 21:37:00
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二月smile

新虫 (初入文坛)
怎么判断有没有污染？

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17楼2015-11-05 22:00:38
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二月smile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 许彦 at 2015-11-05 21:37:00
就是说这个是污染了。你被稀释的样本显示不出来。
...

怎么判断有没有被污染？

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18楼2015-11-06 00:37:04
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许彦

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 二月smile at 2015-11-06 00:37:04
怎么判断有没有被污染？
...

阴性对造或者空白

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19楼2015-11-06 04:08:26
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wjf7862203

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 二月smile at 2015-11-05 21:22:31
还有。你都是在超净台中操作的吗？一定要吗？如果是，涡旋离心是怎么操作的？
...

我稀释一般会在外面稀释，稀释时候容易污染，主要是溅出来，如果你是用枪头吹打混匀，枪头最好在液面之下吹打，如果是涡旋混匀，注意管子打开前，瞬离一下，注意管子要盖好，勤换手套。关于加样，一般会在超净工作台，或者是生物安全柜中，也是为了防止污染，尤其是污染你的试剂。你模板加1ul，容易照成加样不准，你可以加多一些，如3-5ul，这样做平行效果会好很多。
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20楼2015-11-06 09:04:38
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