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wjf7862203

铁虫 (小有名气)

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13楼: Originally posted by 二月smile at 2015-11-05 21:18:43
强阳污染指什么?
...

强阳性污染,你这来主要是高浓度的质粒污染你的样品或试剂。你可以加入阴性对照排除是否污染。
21楼2015-11-06 09:07:00
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二月smile

新虫 (初入文坛)

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20楼: Originally posted by wjf7862203 at 2015-11-06 09:04:38
我稀释一般会在外面稀释,稀释时候容易污染,主要是溅出来,如果你是用枪头吹打混匀,枪头最好在液面之下吹打,如果是涡旋混匀,注意管子打开前,瞬离一下,注意管子要盖好,勤换手套。关于加样,一般会在超净工作 ...

昨天稀释的Ct值分开了,但是没稀释好,3次方的时候在24循环,我有必要稀释到2次方吗?阴性对照是把样品换成水,然后溶解曲线只有一个二聚体的峰值吗?阴性对照也要做平行吗?

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22楼2015-11-06 11:05:14
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wjf7862203

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
22楼: Originally posted by 二月smile at 2015-11-06 11:05:14
昨天稀释的Ct值分开了,但是没稀释好,3次方的时候在24循环,我有必要稀释到2次方吗?阴性对照是把样品换成水,然后溶解曲线只有一个二聚体的峰值吗?阴性对照也要做平行吗?
...

3次方的时候在24循环,可以继续稀释,到1次方也没有问题,阴性对照可以不做平行,保险你可以做个平行。做标准曲线,稀释很关键,多稀释几次,十倍比稀释,应该相差3.3几个循环,比较稳定的
23楼2015-11-06 11:39:20
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二月smile

新虫 (初入文坛)

我的另一个基因,在稀释到3次方的时候,溶解曲线就会出现杂峰,曲曲折折,跟其他峰不同,也是没稀释好吗?还是对于这个基因来说,3次方浓度太低了。

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24楼2015-11-06 15:56:52
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二月smile

新虫 (初入文坛)

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23楼: Originally posted by wjf7862203 at 2015-11-06 11:39:20
3次方的时候在24循环,可以继续稀释,到1次方也没有问题,阴性对照可以不做平行,保险你可以做个平行。做标准曲线,稀释很关键,多稀释几次,十倍比稀释,应该相差3.3几个循环,比较稳定的...

我的另一个基因,在稀释到3次方的时候,溶解曲线就会出现杂峰,曲曲折折,跟其他峰不同,也是没稀释好吗?还是对于这个基因来说,3次方浓度太低了?

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25楼2015-11-06 16:02:44
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dongrh1981

金虫 (正式写手)

从你的溶解曲线看,扩增效率还不错,二聚体等比较少,引物设计和PCR过程应该没有什么问题,所以关键问题出在质粒稀释上,10次方以上的质粒浓度贼拉高,容易形成气溶胶,造成环境污染,在这种状态下,质粒稀释到一定程度就无法再稀释下去了(受环境中的气溶胶污染,会维持在一定的浓度,比如1000~10000个拷贝),所以解决的办法是稀释到一定浓度,比如10的7次方或6次方,然后将稀释后的10的6次方质粒换一个没有进行该高浓度质粒操作的实验室,继续往下稀释至100000,10000,1000,100等等。
总而言之一句话,质粒污染了环境,在稀释高浓度质粒时要带好口罩帽子穿实验服,换个房间继续稀释至低浓度时要换掉口罩帽子和实验服,否则还是会污染。必要时连移液器、枪头、枪头盒、EP管等都要分开使用,质粒污染很恐怖,需要特别注意。
另外,稀释也要注意点,1ul到9ul TE中很容易稀释不准,扩大稀释体积是一个不错的选择。
希望对您有帮助。
呼吸的痛
26楼2015-11-06 20:12:42
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二月smile

新虫 (初入文坛)

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26楼: Originally posted by dongrh1981 at 2015-11-06 20:12:42
从你的溶解曲线看,扩增效率还不错,二聚体等比较少,引物设计和PCR过程应该没有什么问题,所以关键问题出在质粒稀释上,10次方以上的质粒浓度贼拉高,容易形成气溶胶,造成环境污染,在这种状态下,质粒稀释到一定 ...

恩恩!谢谢!我再试试。我还想问个问题,阴性对照在荧光定量上怎么设置,还是当作未知样品?

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27楼2015-11-07 00:09:57
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二月smile

新虫 (初入文坛)

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27楼: Originally posted by 二月smile at 2015-11-07 00:09:57
恩恩!谢谢!我再试试。我还想问个问题,阴性对照在荧光定量上怎么设置,还是当作未知样品?
...

我昨天做的一组,阴性对照有扩增,样品差不多。质粒从5次方Ct值就分不开了。是气溶胶造成的吗?

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28楼2015-11-07 14:33:36
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