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二月smile

新虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 163.8
帖子: 46
在线: 36.4小时
虫号: 3754835
注册: 2015-03-21
性别: MM
专业: 环境微生物学

[求助] 标曲溶解曲线单一峰，但梯度稀释后，Ct值基本无差别，线性很差，扩增效率高的吓人已有1人参与

如图，不知道是怎么回事啊，理论上，不同梯度的浓度的质粒的Ct值是有差别的，可以分开的啊。我做的另一个基因是可以分开的，为什么这个的Ct值都在一起呢。我是按1ul+9ul稀释的。扩增条件是：94℃预变性4min，45个循环为94℃变性45s，61℃退火45s,72℃延1min，最后再在72℃延伸20min。体系是：引物10uM各 1ul，mix12.5，双蒸水10，模板1ul（10ng/ul）. 新手求助！急！！急！！急！！

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标曲溶解曲线单一峰，但梯度稀释后，Ct值基本无差别，线性很差，扩增效率高的吓人-1

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标曲溶解曲线单一峰，但梯度稀释后，Ct值基本无差别，线性很差，扩增效率高的吓人-2

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1楼2015-11-05 11:00:13

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dongrh1981

金虫 (正式写手)

MolEPI: 1
应助: 15 (小学生)
金币: 1036.1
红花: 3
帖子: 695
在线: 92.5小时
虫号: 809546
注册: 2009-07-15
性别: GG
专业: 生物化学

从你的溶解曲线看，扩增效率还不错，二聚体等比较少，引物设计和PCR过程应该没有什么问题，所以关键问题出在质粒稀释上，10次方以上的质粒浓度贼拉高，容易形成气溶胶，造成环境污染，在这种状态下，质粒稀释到一定程度就无法再稀释下去了（受环境中的气溶胶污染，会维持在一定的浓度，比如1000~10000个拷贝），所以解决的办法是稀释到一定浓度，比如10的7次方或6次方，然后将稀释后的10的6次方质粒换一个没有进行该高浓度质粒操作的实验室，继续往下稀释至100000,10000,1000,100等等。
总而言之一句话，质粒污染了环境，在稀释高浓度质粒时要带好口罩帽子穿实验服，换个房间继续稀释至低浓度时要换掉口罩帽子和实验服，否则还是会污染。必要时连移液器、枪头、枪头盒、EP管等都要分开使用，质粒污染很恐怖，需要特别注意。
另外，稀释也要注意点，1ul到9ul TE中很容易稀释不准，扩大稀释体积是一个不错的选择。
希望对您有帮助。