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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » In-fusion 连接
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fMssop

新虫 (初入文坛)

[求助] In-fusion 连接 已有1人参与

实验室采用In-fusion 连接的方法，连接质粒与目的片段。 将质粒用相应酶切之后，用In-fusion酶连接，之后转化。发现连接效率特别低，生长周期很长，甚至出现过连接不上的情况，请问有什么解决方法。体系如下

IN-fusion 酶 1微升
载体      2微升
目的片段 2微升
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1楼 2015-10-20 21:48:28
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骆驼人

金虫 (正式写手)
酶切之后最好胶回收，或纯化一下

发自小木虫Android客户端
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愿你，温柔又坚定，不轻易许诺但许的诺一定会实现，有勇气有力量，会发现一切美好的事物
2楼2015-10-20 22:54:38
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赵鑫易

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
说一下我的个人做法，
1.质粒载体，双酶切后再回收总感觉浓度不够，索性20u酶切体系中加入1ug质粒酶切（限制酶说明是1-1.5ug），然后按infusion说明书上说的，酶切后65°c（大概是这个）保温几分钟使限制酶失活，每次做的时候取3ul左右（放了半个月左右，又拿出来用了一次还是没问题）。
2.pcr产物试剂盒纯化后测下浓度，适当稀释后使用

lz配方写的太简略了，没说什么牌子什么产品，并且没有说明质粒和片段浓度，还有，lz你是不是没加缓冲液
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3楼2015-10-20 23:39:41
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tolobio

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
nono2009: 金币-20, 屏蔽内容, 违规存档, 禁止回帖广告 2015-10-25 10:08:49
本帖内容被屏蔽
4楼2015-10-21 08:16:13
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fMssop

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 赵鑫易 at 2015-10-20 23:39:41
说一下我的个人做法，
1.质粒载体，双酶切后再回收总感觉浓度不够，索性20u酶切体系中加入1ug质粒酶切（限制酶说明是1-1.5ug），然后按infusion说明书上说的，酶切后65°c（大概是这个）保温几分钟使限制酶失活，每 ...

酶是TAKARA公司的，貌似不用缓冲液，直接加酶。片段和载体大概100ng/ul左右。
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5楼2015-10-22 18:09:27
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