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LY1199

铁虫 (小有名气)

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性别: GG
专业: 微生物生态学

[求助] 关于荧光定量PCR 标准曲线的问题已有1人参与

我用绝对定量的 qPCR 测定某个基因A在土壤样品中的copy数目
            查了好多文献，大都是：采用还有这个A基因的单拷贝质粒DNA进行标准曲线的制备，将其稀释到一定倍数，
            这里产生了疑问
         1）为什么要构建含A基因的单拷贝质粒
         2）直接利用A基因的PCR产物进行目的片段浓度确定，再转换成copies/ul等形式，不可以吗？？为什么？？

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1楼 2015-10-20 09:26:08

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LY1199

铁虫 (小有名气)

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专业: 微生物生态学

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2楼2015-10-20 09:28:39

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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
LY1199: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-11-21 14:10:34

使用质粒有以下原因：
（1）很多实验者都推荐之。
（2）质粒比较纯。
（3）质粒稳定。
（4）质粒定量准确。
（5）质粒制备方便，廉价，大量。
（6）使用质粒来开始学习/试验real time PCR, 可以减少模板误差，就易于摸索其它条件的优化。

PCR产物也可以，但是：
（1）短，线性→不稳定。
（2）模板就是扩增子，末端就是引物结合部位，端点降解直接影响引物结
合。