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LY1199

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于荧光定量PCR 标准曲线的问题 已有1人参与

我用绝对定量的 qPCR 测定某个基因A在土壤样品中的copy数目
               查了好多文献,大都是:采用还有这个A基因的单拷贝质粒DNA进行标准曲线的制备,将其稀释到一定倍数,
               这里产生了疑问
            1)为什么要构建含A基因的单拷贝质粒
            2)直接利用A基因的PCR产物进行目的片段浓度确定,再转换成copies/ul等形式,不可以吗??为什么??
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LY1199

铁虫 (小有名气)

在线等 急
2楼2015-10-20 09:28:39
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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
LY1199: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-11-21 14:10:34
使用质粒有以下原因:
(1) 很多实验者都推荐之。
(2) 质粒比较纯。
(3) 质粒稳定。
(4) 质粒定量准确。
(5) 质粒制备方便,廉价,大量。
(6) 使用质粒来开始学习/试验real time PCR, 可以减少模板误差,就易于摸索其它条件的优化。

PCR产物也可以,但是:
(1) 短,线性→不稳定。
(2) 模板就是扩增子,末端就是引物结合部位,端点降解直接影响引物结
合。
3楼2015-10-23 16:48:04
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)

楼上完全正确。此外 pcr 产物做模版,扩增效率没有质粒高,有时可能卡在70%再上不去了。因为引物anneal到质粒上的概率要高于pcr 片段,因为pcr两端再无其他序列可target。

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向钱看,向厚赚
4楼2015-10-26 00:11:27
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刘阿杰T

新虫 (小有名气)

请教一下,不太懂QPCR的做法,只能先提取RNA,再反转录为cDNA 再进行以后的步骤,还是可以直接用DNA也可以?

发自小木虫IOS客户端
5楼2017-11-22 10:25:32
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