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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于荧光定量PCR 标准曲线的问题
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LY1199

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于荧光定量PCR 标准曲线的问题 已有1人参与

我用绝对定量的 qPCR 测定某个基因A在土壤样品中的copy数目
               查了好多文献，大都是：采用还有这个A基因的单拷贝质粒DNA进行标准曲线的制备，将其稀释到一定倍数，
               这里产生了疑问
            1）为什么要构建含A基因的单拷贝质粒
            2）直接利用A基因的PCR产物进行目的片段浓度确定，再转换成copies/ul等形式，不可以吗？？为什么？？
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1楼 2015-10-20 09:26:08
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刘阿杰T

新虫 (小有名气)
请教一下，不太懂QPCR的做法，只能先提取RNA，再反转录为cDNA 再进行以后的步骤，还是可以直接用DNA也可以？

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5楼2017-11-22 10:25:32
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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
LY1199: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-11-21 14:10:34
使用质粒有以下原因：
（1） 很多实验者都推荐之。
（2） 质粒比较纯。
（3） 质粒稳定。
（4） 质粒定量准确。
（5） 质粒制备方便，廉价，大量。
（6） 使用质粒来开始学习/试验real time PCR, 可以减少模板误差，就易于摸索其它条件的优化。

PCR产物也可以，但是：
（1） 短，线性→不稳定。
（2） 模板就是扩增子，末端就是引物结合部位，端点降解直接影响引物结
合。
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3楼2015-10-23 16:48:04
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)
楼上完全正确。此外 pcr 产物做模版，扩增效率没有质粒高，有时可能卡在70%再上不去了。因为引物anneal到质粒上的概率要高于pcr 片段，因为pcr两端再无其他序列可target。

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向钱看，向厚赚
4楼2015-10-26 00:11:27
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