应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导
141/2返回列表12下一页
查看: 3133  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

天宇201266

金虫 (正式写手)

[求助] 关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导 已有6人参与

本人做Hind III与Xho I 的双酶切连接，一直没有做成，做了将近5个月了，自己将近机关算尽还是没有做出来，现想各位大神求助。现将自己的情况描述如下，自己通过PCR扩增，来获得目的片段510bp，获得的目的片段两端5'是Xho I 酶切位点，3'是Hind III酶切位点，而所要连得载体是pET-28a（之前已经插入一个启动子共5610bp），分别用Hind II 与Xho I双酶切载体与片段，
   双酶切体系是：  目的片段/载体：5 ul
                           10x M buffer   :   1ul
                           Hind III/Xho I  :    0.5ul
                           ddH2O         ：3ul
酶切之后的胶回收之后的跑胶电泳图如图片1
  酶切连接之后的单双酶切验证的体系是：
      双酶切验证   ：质粒             ：5 ul                                     Hind III 单酶切验证 ：质粒：5 ul           Xho I 单酶切验证：质粒：5 ul
                           10x K buffer   :   1ul                                                          10x K buffer   :   1ul                            10x K buffer   :   1ul
                           Hind III/Xho I  :    0.5ul                                                        Hind III  :    0.5ul                                      Xho I :    0.5ul
                           ddH2O         ：3ul                                                                ddH2O         ：3.5ul                             ddH2O         ：3.5ul
单双酶切验证的图片如图2和如图3，图2与图3分别对应于同一个质粒。自己做酶切连接跟酶切验证的结果一直是这样，求各位大神指导，该如何设置片段与载体的比例？如何做酶切连接的体系，谢谢！

关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导
图片1.jpg


关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导-1
图片2，Hind III 单酶切以及 Hind III +Xho I双酶切验证，从右向左一次是单双酶切.jpg


关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导-2
图片3，Xho I 单酶切以及 Hind III +Xho I双酶切验证，从左向右一次是双单酶切.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
在路上。。。
1楼 2015-10-16 13:53:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+5, ★有帮助 2015-10-17 20:42:56
这个两个酶切位点应该是很好切，也好连。楼主做的时候一定要注意几点：
1.你PCR产物两端要各加3个保护碱基，一般HindIII加GGG，XhoI加CGG碱基，可以参考有关文献；这样才能保证酶能将PCR产物末端切开；
2.酶切体系中DNA量及酶切时间。PCR产物及载体量不宜过多，酶切时间要足够，现在快切酶10～15分钟可以切好，但还是建议切30分钟以上，载体可以切2h，酶切完全是试验成功的第一步。
3.一般来说载体和DNA片段1：3（摩尔比）连接效果比较好。一般情况下，由于载体碱基比DNA片段多2～3倍，从DNA电泳图看，载体和DNA亮度一样的量基本合适。
赞一下(2人) 回复此楼
9楼2015-10-17 09:27:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
4楼2015-10-16 18:36:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

你太善良

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+1, ★有帮助 2015-10-20 20:12:20
每次批量操作10个载体的经验来说，片段和载体比例不是重要的。要点是酶切彻底，回收试剂盒好，回收电泳要换新的电泳也。

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2015-10-16 23:36:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ziyou.abc

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wxb2061 at 2015-10-16 23:25:54
一直不明白，载体和片段，他们质量ng是怎么确定的
...

取1ul用微型分光光度计测一下浓度，是X（ng/ul），乘以ul 数就是ng了
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2015-10-19 16:54:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

tolobio

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 请勿刷应助指数，已经看到您很多次无用的应助了。谢谢你的理解与配合。 2015-10-16 20:21:18
天宇201266: 金币+1, 老板不会同意的 2015-10-17 20:41:23
建议还是送到公司来做吧，比较省事，价格也不贵，做不出还不收费：http://www.tolobio.com/service_detail.php?id=110
相亲咨询：support@tolobio.com
赞一下 回复此楼
2楼2015-10-16 15:39:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wxb2061

银虫 (小有名气)
同样求助片段与载体比例的问题

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
走在途中……
3楼2015-10-16 18:19:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wxb2061

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-10-16 18:36:10
用这个吧，效果挺好的

...

谢谢

发自小木虫Android客户端
回复此楼
走在途中……
5楼2015-10-16 23:24:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wxb2061

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-10-16 18:36:10
用这个吧，效果挺好的

...

一直不明白，载体和片段，他们质量ng是怎么确定的

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
走在途中……
6楼2015-10-16 23:25:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Eternity宇

禁虫 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+1, ★有帮助 2015-10-20 20:12:47
本帖内容被屏蔽
8楼2015-10-17 00:01:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

赵鑫易

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+1, ★有帮助 2015-10-19 08:53:34
直接换方法吧，现在用无缝连接，直接出来，之前也是浪费好多时间学了一堆无用的知识
赞一下 回复此楼
10楼2015-10-18 16:02:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 天宇201266 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 281求调剂（0805） +3 烟汐忆海 2026-03-16 9/450 2026-03-18 07:23 by 烟汐忆海
[考研] 0703化学336分求调剂 +5 zbzihdhd 2026-03-15 6/300 2026-03-18 04:34 by anny19840123
[考研] 材料专硕306英一数二 +8 z1z2z3879 2026-03-16 10/500 2026-03-18 00:01 by 星空星月
[考研] 085601专硕，总分342求调剂，地区不限 +4 share_joy 2026-03-16 4/200 2026-03-17 21:32 by hmn_wj
[考研] 308求调剂 +4 是Lupa啊 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:12 by ruiyingmiao
[硕博家园] 深圳大学硕士招生（2026秋，传感器方向，仅录取第一志愿） +4 xujiaoszu 2026-03-11 9/450 2026-03-17 10:29 by xujiaoszu
[考研] 283求调剂 +3 听风就是雨； 2026-03-16 3/150 2026-03-17 07:41 by 热情沙漠
[基金申请] 今年的国基金是打分制吗？ 50+3 zhanghaozhu 2026-03-14 3/150 2026-03-16 17:07 by 北京莱茵润色
[考研] 070303 总分349求调剂 +3 LJY9966 2026-03-15 5/250 2026-03-16 14:24 by xwxstudy
[考研] 0856求调剂 +3 刘梦微 2026-03-15 3/150 2026-03-16 10:00 by houyaoxu
[考研] 080500，材料学硕302分求调剂学校 +4 初识可乐 2026-03-14 5/250 2026-03-14 21:08 by peike
[考研] 265求调剂 +4 威化饼07 2026-03-12 4/200 2026-03-14 17:23 by userper
[基金申请] 现在如何回避去年的某一个专家，不知道名字 +3 zk200107 2026-03-12 6/300 2026-03-14 17:13 by zk200107
[考研] 0703，333分求调剂 一志愿郑州大学-物理化学 +3 李魔女斗篷 2026-03-11 3/150 2026-03-13 22:24 by JourneyLucky
[考研] 求材料调剂 +5 隔壁陈先生 2026-03-12 5/250 2026-03-13 22:03 by 星空星月
[考研] 281求调剂 +9 Koxui 2026-03-12 11/550 2026-03-13 20:50 by Koxui
[考研] 材料工程调剂 +4 咪咪空空 2026-03-11 4/200 2026-03-13 19:57 by JourneyLucky
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 070303一志愿西北大学学硕310找调剂 +3 d如愿上岸 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:43 by houyaoxu
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭