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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导
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天宇201266

金虫 (正式写手)

[求助] 关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导 已有6人参与

本人做Hind III与Xho I 的双酶切连接，一直没有做成，做了将近5个月了，自己将近机关算尽还是没有做出来，现想各位大神求助。现将自己的情况描述如下，自己通过PCR扩增，来获得目的片段510bp，获得的目的片段两端5'是Xho I 酶切位点，3'是Hind III酶切位点，而所要连得载体是pET-28a（之前已经插入一个启动子共5610bp），分别用Hind II 与Xho I双酶切载体与片段，
   双酶切体系是：  目的片段/载体：5 ul
                           10x M buffer   :   1ul
                           Hind III/Xho I  :    0.5ul
                           ddH2O         ：3ul
酶切之后的胶回收之后的跑胶电泳图如图片1
  酶切连接之后的单双酶切验证的体系是：
      双酶切验证   ：质粒             ：5 ul                                     Hind III 单酶切验证 ：质粒：5 ul           Xho I 单酶切验证：质粒：5 ul
                           10x K buffer   :   1ul                                                          10x K buffer   :   1ul                            10x K buffer   :   1ul
                           Hind III/Xho I  :    0.5ul                                                        Hind III  :    0.5ul                                      Xho I :    0.5ul
                           ddH2O         ：3ul                                                                ddH2O         ：3.5ul                             ddH2O         ：3.5ul
单双酶切验证的图片如图2和如图3，图2与图3分别对应于同一个质粒。自己做酶切连接跟酶切验证的结果一直是这样，求各位大神指导，该如何设置片段与载体的比例？如何做酶切连接的体系，谢谢！

关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导
图片1.jpg


关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导-1
图片2，Hind III 单酶切以及 Hind III +Xho I双酶切验证，从右向左一次是单双酶切.jpg


关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导-2
图片3，Xho I 单酶切以及 Hind III +Xho I双酶切验证，从左向右一次是双单酶切.jpg
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在路上。。。
1楼 2015-10-16 13:53:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+5, ★有帮助 2015-10-17 20:42:56
这个两个酶切位点应该是很好切，也好连。楼主做的时候一定要注意几点：
1.你PCR产物两端要各加3个保护碱基，一般HindIII加GGG，XhoI加CGG碱基，可以参考有关文献；这样才能保证酶能将PCR产物末端切开；
2.酶切体系中DNA量及酶切时间。PCR产物及载体量不宜过多，酶切时间要足够，现在快切酶10～15分钟可以切好，但还是建议切30分钟以上，载体可以切2h，酶切完全是试验成功的第一步。
3.一般来说载体和DNA片段1：3（摩尔比）连接效果比较好。一般情况下，由于载体碱基比DNA片段多2～3倍，从DNA电泳图看，载体和DNA亮度一样的量基本合适。
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9楼2015-10-17 09:27:11
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
4楼2015-10-16 18:36:10
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你太善良

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+1, ★有帮助 2015-10-20 20:12:20
每次批量操作10个载体的经验来说，片段和载体比例不是重要的。要点是酶切彻底，回收试剂盒好，回收电泳要换新的电泳也。

发自小木虫Android客户端
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7楼2015-10-16 23:36:18
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ziyou.abc

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wxb2061 at 2015-10-16 23:25:54
一直不明白，载体和片段，他们质量ng是怎么确定的
...

取1ul用微型分光光度计测一下浓度，是X（ng/ul），乘以ul 数就是ng了
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2015-10-19 16:54:43
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普通回帖

tolobio

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 请勿刷应助指数，已经看到您很多次无用的应助了。谢谢你的理解与配合。 2015-10-16 20:21:18
天宇201266: 金币+1, 老板不会同意的 2015-10-17 20:41:23
建议还是送到公司来做吧，比较省事，价格也不贵，做不出还不收费：http://www.tolobio.com/service_detail.php?id=110
相亲咨询：support@tolobio.com
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2楼2015-10-16 15:39:15
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wxb2061

银虫 (小有名气)
同样求助片段与载体比例的问题

发自小木虫Android客户端
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走在途中……
3楼2015-10-16 18:19:36
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wxb2061

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-10-16 18:36:10
用这个吧，效果挺好的

...

谢谢

发自小木虫Android客户端
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走在途中……
5楼2015-10-16 23:24:25
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wxb2061

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-10-16 18:36:10
用这个吧，效果挺好的

...

一直不明白，载体和片段，他们质量ng是怎么确定的

发自小木虫Android客户端
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走在途中……
6楼2015-10-16 23:25:54
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+1, ★有帮助 2015-10-20 20:12:47
本帖内容被屏蔽
8楼2015-10-17 00:01:29
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赵鑫易

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+1, ★有帮助 2015-10-19 08:53:34
直接换方法吧，现在用无缝连接，直接出来，之前也是浪费好多时间学了一堆无用的知识
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10楼2015-10-18 16:02:47
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